Монослойное культивирование на микроносителях

Сочетать положительные стороны монослойного и суспензионного культивирования позволяет использование системы с микроносителями. Микроносители – мелкие твердые частицы (поддерживаемые в суспензии благодаря перемешиванию), на поверхности которых клетки растут в виде монослоя. Использование микроносителей дает клеткам, обладающим адгезивными свойствами, все преимущества крупномасштабных суспензионных культур.

Микроносители должны быть нетоксичными, не сорбировать компоненты питательных сред и продукты метаболизма клеток, а также иметь поверхностный заряд или обменную емкость, достаточную для прикрепления клеток. Коммерческие микроносители имеют диаметр 100-200 мкм и подразделяются на 6 основных групп:

1. декстрановые микроносители поперечно сшитые типа Cytodex 1;

2. декстрановые микроносители типа Cytodex 2;

3. микроносители, покрытые коллагеном или желатином типа Cytodex 3;

4. полистиреновые микроносители типа Biosilon, Cytospheres;

5. стеклянные микроносители типа Bioglass;

6. целлюлозные микроносители типа ДЕ-53.

Используемые в настоящее время микроносители на основе микропористого желатина или пористого боросиликатного стекла имеют емкость около 3000 клеток/микроноситель.

Питательные среды

Оптимизация состава питательных сред для культур животных клеток развивалась в двух направлениях – разработка сред, требующих внесения природных добавок (сыворотки, эмбриональные экстракты и др.), и создание сред химически определенного состава.

В настоящее время наиболее широко применяются среды, содержащие источники энергии (углеводы) и азота; незаменимые аминокислоты; витамины; неорганические соли – источники макро- и микроэлементов, включая селенит; нуклеозиды; жиры и жирорастворимые компоненты; гормоны (инсулин, трансферрин, глюкокортикоиды, эстроген, андроген, тироксин, трииодтиронин); ростовые факторы (фактор роста, синтезируемый тромбоцитами, фактор роста фибробластов, фактор роста эпидермиса), а также сыворотку (до 10%) и в ряде случаев некоторые другие добавки (бактопептон, триптозофосфат и т. п.).

В 40-50-е годы прошлого века большая часть клеток выращивалась в плазме или на фибриногеновом сгустке в присутствии тканевых экстрактов или их ультрафильтратов. Начиная со среды 199, предложенной Г. Мортоном в 1950 году и содержащей более 60 синтетических ингредиентов, широко осуществляется подбор состава и методов приготовления различных питательных сред. В своей классической работе в 1955 году Х. Игл исследовал потребности клеточных линий мышей L и HeLa в питательных веществах. Это злокачественные клетки, характеризующиеся различным кариотипом и сходные по своей морфологии с клетками плоского эпителия. Игл использовал среды определенного состава, содержащие смесь аминокислот, витаминов, солей и углеводов, а также небольшое количество диализированной сыворотки лошади или человека. В ходе исследований 27 факторов были определены как незаменимые для роста. Они составили основу среды, известной как «базальная среда Игла», или БСИ. Из 20 аминокислот 13 оказались незаменимыми, а остальные 6 могли быть синтезированы клетками из других источников углерода. Удаление любого из 7 витаминов приводило к развитию симптомов недостаточности. Таким образом, Игл, используя метод культивирования клеток, продемонстрировал питательные потребности клеток мыши и человека. Вскоре БСИ была заменена минимальной средой Игла (МСИ), в которой концентрация различных компонентов была повышена, что обеспечивало непрерывный рост клеток в культуре в течение нескольких суток без смены среды. Указанные среды широко используются для культивирования различных клеточных линий. Сыворотка в их составе служит источником не идентифицированных факторов.

До сих пор нет общего мнения относительно роли сыворотки в клеточных культурах, как нет и общего мнения относительно физиологической роли некоторых ее компонентов. Считается, что сыворотка обеспечивает клетки гормональными факторами, стимулирующими их рост и функции, служит источником низкомолекулярных соединений, требующихся клеткам в очень малых дозах и переносимых сывороточными белками, а также обеспечивает клетки незаменимыми соединениями. В конце 50-х годов было показано, что ά-глобулиновая сывороточная фракция (фетуин) способствует прикреплению клеток к стеклу и их распластыванию, т.е. процессам, необходимым для размножения клеток. В сыворотке содержатся коллаген и фибронектин. В 70-х годах исследователей заинтересовала роль сывороточного альбумина в культурах в связи со способностью этого белка служить переносчиком для небольших молекул гормонов, которые могут стимулировать in vivo или in vitro рост различных типов клеток.

Однако, культивирование клеток в присутствии сыворотки обнаруживает ряд недостатков:

1. Для большинства клеток сыворотка не является физиологической жидкостью, с которой они контактировали в исходной ткани;

2. Часто недооценивается возможность цитотоксичности сыворотки;

3. Сыворотки могут содержать недостаточное количество специфических для данного вида клеток ростовых факторов;

4. Возможны изменения свойств сыворотки от партии к партии.

В настоящее время предпринимаются попытки создания и применения бессывороточных питательных сред, в которых сыворотка заменяется смесью гормонов (инсулин, трансферрин, глюкокортикоиды и др.) и ростовых факторов. Эти среды необходимы, если по условиям эксперимента требуется избежать присутствия чужеродного белка и из-за высокой стоимости эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота. Однако в настоящее время бессывороточные среды имеют существенные недостатки: добавление в дешевую среду гормонов и факторов роста делает ее такой же дорогой, как среда с сывороткой. Кроме того, чаще всего бессывороточные среды пригодны для ограниченного числа клеток.

Одна из проблем, возникающих при попытках получить культуры одиночных клеток или культуры клеток с низкой плотностью (100 кл\мл), заключается в том, что в этих условиях клетки погибают или растут очень медленно. В результате подробных исследований была разработана концепция “кондиционированной среды”. Кондиционированная среда – это среда, в которой концентрация метаболитов находится на таком уровне, что наступает равновесие между выходом метаболитов из клеток в среду и обратным захватом этих метаболитов клетками.

Поиск по сайту: