Методы выявления микоплазм

Микоплазмы –это прокариоты малых размеров, имеют только цитоплазматическую мембрану и не способны синтезировать пептидогликан. Это полиморфные микроорганизмы, по форме представляют собой сферические или грушевидные структуры, а также разветвленные или спиральные нити, как правило, неподвижны. Клетки микоплазм, в отличие от других прокариот, не имеют клеточной стенки. Снаружи ЦПМ находится капсулоподобный слой. Морфологию микоплазм изучают в живом состоянии в фазово-контрастном микроскопе и путем электронной микроскопии ультратонких срезов их клеток. По Граму окрашиваются медленно, грамотрицательны.

Хламидии. (Морфология, жизненный цикл хламидий).

Хламидии - мелкие, чувствительные к антибиотикам бактерии диаметром около 0,2-1,5 мкм, которые развиваются только внутри живых клеток («облигатные внутриклеточные паразиты») н вызывают широкий спектр патологических процессов у человека н животных. Естественный цикл развития хламидий проходит в цитоплазматических включениях живых клеток (элементарное тельце - ретикулярное тельце — ретикулярные тельца - промежуточные тельца - элементарные тельца) и продолжается от двух до трех суток. Завершив цикл размножения, хламидии разрушают цитоплазматические включения, выходят из клетки-хозяина во внешнюю среду и заражают новые клетки.

По современной классификации хламидии относят к роду Chlamidia семейства Chlamidiaceae порядка Chlamidiales. Вид С. trachomatis - возбудитель антропонозных хламидийных инфекций, первично поражающих слизистые оболочки (трахома, урогенитальный хламидиоз, венерическая лимфогранулема); это - один из самых распространенных и наиболее актуальных возбудителей заболеваний, передаваемых половым путем.

Возбудитель венерической лимфогранулемы имеет биологическое отличие от возбудителей других урогенитальных хламидиозов. Он имеет выраженный тропизм к лимфоидной ткани и встречается в Юго-Восточной Азии.

Методы выявления хламидий

Хламидии обычно выявляются в клетках плоского, а не цилиндрического эпителия. Клетки с хламидиями располагаются группами по 4-6 штук; хроматин в них распределен причудливо, грубые его нагромождения чередуются с просветлениями, цитоплазма клетки слегка вакуолизирована. В части случаев хламидии располагаются в виде внутриклеточных элементарных телец. Позднее они становятся крупнее, делаются менее плотными и располагаются внутри крупной вакуоли вблизи ядра. Хламидии чувствительны к тетрациклинам, макролидам и рифампицину, а L-формы бактерий чувствительны к эритромицину и рондомицину.

Хламидии окрашиваются по Романовскому-Гимзе, грамотрицательны, хорошо видны в нативных препаратах при фазово-контрастной микроскопии. Методика окраски по Романовскому-Гимзе.

Методы выявления риккетсий

Риккетсии – грамотрицательные микроорганизмы малых размеров. Они занимают промежуточное положение между бактериями и вирусами. С бактериями они сходны по морфологии. Внутриклеточное размножение и паразитизм на энергетическом уровне сближают их с вирусами. Окисляют глутамат с образованием АТФ.

По величине они крупнее вирусов, не проходят через фильтры и обнаруживаются в оптическом микроскопе.

По П. Ф. Здродовскому наблюдаются 4 морфологических типа риккетсий (циклы развития риккетсии):

1) кокковидные (0,5 мкм),

2) палочковидные (короткие - 1-1,5 мкм),

3) бациллярные (длинные, изогнутые - 3-4 мкм),

4) нитевидные (20-40 мкм).

Риккетсии выявляются в окраске по методу Грама (грамотрицательные), по методу Романовского-Гимзы, по методу Здродовского и нативных препаратах (удобен и прост метод окраски риккетсий по Здродовскому)

Теоретическая справка

к Работе № 2

Техника приготовления препаратов

1. Приготовление мазка

1) с жидкой питательной среды 2) с плотной питательной среды

культуру берут петлей и каплю наносят на предметное стекло наносят

непосредственно на стекло (без воды) небольшую каплю воды, в которой

эмульгируют исследуемый материал

и распределяют на площади около 2 см²

2. Высушивание

на воздухе высоко над пламенем спиртовки

мазком вверх

3. Фиксация

Цель: - прикрепить микробов к стеклу

- обеззаразить патогенные микробы

- убитые микробы лучше окрашиваются

Методы

физическийхимический

- над пламенем спиртовки мазком - более щадящий по сравнению

вверх (3 раза круговыми движениями) с физическим: мазок погружают

в фиксатор (этанол, ацетон, формалин

и др.) на определенное время

4. Окраска

Методы

простыесложные

(ориентировочные) (дифференцирующие)

1) окрашивают одним красителем 1) используют несколько красителей

анилинового ряда - основным или (основная и вспомогательные краски,

кислым: - кислый фуксин обесцвечивающие жидкости (этанол)

- эозин - метод Грама

- метиленовый синий - окраска по Нейссеру

- генциановый фиолетовый - Гинса-Бурри

- Ожешко

2) используются для изучения 2) используются для определения

морфологии микроорганизмов морфологии, химического состава,

структуры микробных клеток

Краситель наливают на поверхность мазка на определенное время, затем мазок промывают до тех пор, пока струи воды не станут бесцветными, осторожно высушивают фильтровальной бумагой. Если мазок правильно окрашен и промыт, то поле зрения абсолютно прозрачно, а клетки микробов интенсивно окрашены.

Методика окраски по Граму:

1 этап. Используется основная краска генциановый фиолетовый, затем раствор Люголя. Образуется прочное комплексное соединение «генциановый фиолетовый + йод». Все микробы окрашиваются в сине-фиолетовый цвет.

2 этап. Обработка этанолом (дифференциация)

одни микробыдругие микробы

сохраняют комплекс генциановый теряют комплекс генциановый

фиолетовый + йод, не обесцвечиваются фиолетовый + йод, обесцвечиваются. Связано с тем, что: Это объясняется тем, что:

- клеточная стенка толстая, - клеточная стенка микробов тонкая,

- в ее состав входит много - пептидогликана мало,

пептидогликана,

- имеются тейхоевые кислоты - тейхоевых кислот нет

- по строению клеточная стенка - структура клеточной стенки

представляет собой прочное мозаичная, рыхлая, поэтому

образование, поэтому после обра- после обработки этанолом поры

ботки этанолом поры клеточной остаются прежними, краска

стенки суживаются и краска не вымывается, микробы обесцве-

вымывается. чиваются

3 этап. Окраска фуксином

одни микробыдругие микробы

остаются сине-фиолетовыми, окрашиваются в красный цвет,

грамположительные: грамотрицательные:

1. Все кокки за исключением 1. Гонококки и менингококки

гонококков и менингококков

2. Все спорообразующие палочки 2. Большинство неспорообразующих

палочек

3. Из неспорообразующих бактерий 3. Спириллы

туберкулезная и дифтерийная палочки

4. Актиномицеты 4. Риккетсии

5. Грибы 5. Микоплазмы

Окраска по методу Грама не используется при изучении спирохет, простейших и вирусов.

Сущность метода окраски по Граму: отношение бактерий к окраске по Граму определяется их способностью удерживать образовавшийся в процессе окраски комплекс генцианового фиолетового и йода. У грамположительных бактерий основным веществом клеточной стенки (до 90%) являются мукопептиды-муреин (пептидогликан). У грамотрицательных бактерий однослойный муреин располагается в глубине клеточной стенки, значительно больше содержится белков и липидов, которые вместе с полисахаридами образуют поверхностные слои в виде мозаики. Кроме того, проницаемость клеточной стенки у грамположительных бактерий меньше, чем у грамотрицательных. Это объясняется большим содержанием мукопептида в составе клеточной стенки грамположительных бактерий и меньшим диаметром пор, что способствует удержанию образовавшегося комплекса при обработке бактерий этиловым спиртом.

Методика окраски по методу Романовского-Гимзы:

Краска Романовского-Гимзы состоит из метиленового синего, эозина и азура.

1. На мазок наносят рабочий раствор красителя (2 капли красителя на 1 мл дистиллированной воды) на 10-20 мин.

2. Препарат промывают водой и высушивают на воздухе.

Трепонемы окрашиваются в бледно-розовый цвет, боррелии - в фиолетовый цвет, лептоспиры - в розовый цвет. Сапрофитные (непатогенные) формы окрашиваются в синий цвет. Морфологию спирохет изучают также в живом состоянии в фазово-контрастном или темнопольном микроскопе. Хорошим методом выявления спирохет является серебрение по Морозову.

Методика окраски по методу Циля - Нильсена:

1. На фиксированный препарат – мазок нанести карболовый раствор фуксина через полоску фильтровальной бумаги и подогреть до появления паров в течение 3-5 мин.

2. Снять бумагу, промыть мазок водой.

3. Нанести 5% раствор серной кислоты или 3% раствор смеси спирта с хлороводородной кислотой на 1-2 мин до обесцвечивания.

4. Промыть водой.

5. Докрасить мазок водным раствором метиленового синего в течение 3-5 мин.

6. Промыть водой, высушить, микроскопировать.

Методика окраски по методу Ожешко:

1. На нефиксированный мазок нанести 0,5% раствор хлороводородной кислоты и подогреть на пламени в течение 2-3 мин.

2. Кислоту слить, препарат промыть водой, просушить и фиксировать над пламенем. Затем окрасить по Цилю-Нильсену. Споры бактерий приобретают красный цвет, а вегетативные формы - синий.

Теоретическая справка

К Работе № 3

Поиск по сайту: