ПО ТЕМЕ «МОРФОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ»

Морфология

Микроорганизмов.

«МОРФОЛОГИЯ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ МИКРОБОВ – ЭУКАРИОТОВ.»

ЗАНЯТИЕ №3

Тема: МОРФОЛОГИЯ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ МИКРОБОВ – ЭУКАРИОТОВ.

Вопросы темы:

1. Строение эукариотической клетки. Отличия от прокариотической.
2. Классификация царства грибов. Морфо-функциональные особенности плесневых грибов.
3. Дрожжи и дрожжеподобные грибы. Роль в патологии человека.
4. Методы исследования грибов.
5. Классификация простейших.
6. Морфо-функциональные особенности различных типов простейших. Патогенные представители.
7. Методы исследования простейших.

Грибы.

Грибы (Mycota, Mycetes, Fungi) представлены одноклеточными или многоклеточными эукариотами, которые по наличию хитина в оболочке, стеролов в цитоплазмотической мембране и гликогена в цитоплазме напоминают клетки животного происхождения, а по наличию клеточной стенки, состоящей из полисахаридов, близких к целлюлозе, способности к неограниченному росту, размножению спорами, неподвижностью в вегетативном состоянии – растения.

У грибов существует два типа роста: гифальный (гифомицеты) и дрожжевой (бластомицеты).

Обычно вегетативное тело гифомицетов состоит из нитей толщиной около 5 мкм, сильно разветвленных и называемых гифами. Гифы либо не имеют поперечных перегородок (у низших грибов), либо разделены перегородками (септами) на клетки (у высших грибов). Стенка клеток может быть различной толщины, часто хорошо видна двухконтурность, среди включений в цитоплазме наиболее характерны зерна волютина, гликогена, пигмента меланина. Зрелые старые клетки грибов богаты липидами. Ядро содержит ядрышко и хроматиновую сеть, клетки могут быть многоядерными. Совокупность гифов образует мицелий (грибницу). Мицелий может быть субстратный, образующийся в результате врастания гифов в питательную среду, и воздушный, растущий на поверхности среды. Мицелий представляет собой ветвящиеся трубки, ветвление осуществляется боковыми выростами гиф. Переплетающиеся гифы с тольстыми оболочками образуют склероции – округлые или неправильной формы скопления размером от долей миллиметра до нескольких сантиметров, предназначенные для выживания в неблагоприятных условиях. Концевые нити некоторых грибов образуют обильные ветвления, по внешнему сходству названные «рогами оленя», «канделябрами», «булавами», «спиралями», «дубинами». По ходу мицелия встречаются узловатые органы различного размера и формы – результат сплетения первичных и вторичных ветвей вокруг материнской ветки. Мицеальные нити иногда располагаются параллельными рядами, тесно прилегая друг к другу и напоминая фитиль, отсюда и название «коремии» (у дерматофитов).

У большинства грибов, имеющих медицинское значение, обнаруживаются разнообразные конидии (экзоспоры), являющиеся формами бесполого размножения. Они могут образовываться на специальных конидиофорах (конидиеносцы), а также по бокам и на концах обычных септированных гиф. Мелкие одноклеточные конидии называются микроконидиями, а крупные, нередко многоклеточные – макроконидиями. Наиболее частыми типами конидий являются следующие типы спор:

1. бластоспоры – образуются в результате почкования, путем отделения почки от родительской клетки, наблюдается у дрожжевых и дрожжеподобных грибов,
2. хламидоспоры – гифальные клетки увеличиваются, к них образуется толстая оболочка,
3. артоспоры – образуются в результате фрагментации гиф на отдельные клетки, встречаются у дерматофитов, дрожжеподобных грибов, возбудителя кокцидиоза,
4. конидиоспоры – возникают на дифференцированных конидиофорах (конидиеносцах) или располагаются по бокам и на концах любой ветви грибницы, прикрепляясь к ней непосредственно или тонкой ножкой (споротрихумы). Кондиеносцы состоят из веточек первичного, вторичного или третичного порядка. На продолговатом или расширенном конце конидиеносца распологаются более короткие столбики (стеригмы), от которого отпочковываются характерные для данного вида конидии, располагающиеся цепочками, придавая конидиеносцу вид кисточки. Форма конидий круглая или овальная, реже грушевидная, стенка бесцветная или темноокрашенная. Конидии развиваются на воздушном мицелии, который за счет этого становится мучнистым и пигментированным. Конидиоспоры характерны для аскомицетов,
5. спорангиоспоры – располагаются на вершине спорангиеносца в специальных органах (спорангиях). Они являются эндоспорами и при разрыве стенок спорангия, попадая в благоприятные условия, прорастают, образуя мицелий. Спорангиоспоры наблюдаются у мукоровых грибов.

Половое размножение обнаружено у патогенных грибов классов Ascomycetes и Zygomycetes (они отнесены к совершенным грибам), при этом образуются следующие разновидности спор:

1. аскоспоры – возникают в сумках (асках). Количество аскоспор в сумке варьирует от 4 до 16 больше. Размеры аскоспор составляют от 2 до 50 мкм. Они имеют цилиндрическую, веретенообразную, лимонообразную или чечевицеподобную форму. Свойственны сумчатым грибам – аскомиуетам.
2. зигоспоры – у некоторых зигомицетов верхушки расположенных близко друг к другу гиф сливаются, происходит мейоз и образуются крупные зигоспоры с толстыми стенками,
3. базидиоспоры – после мейоза на поверхности особой клетки, называемой базидиумом, на вершине каждой круглой или удлиненной базидиоспоре, что характерно для базидиомицетов.

Кроме гифальных форм грибов существуют и бластомицеты (дрожжевые и дрожжеподобные грибы). Они представляют собой сферические, овоидные или грушевидные формы размером 3-15 мкм. Эти клетки содержат включения гликогена, волютина, липиды, они способны к почкованию, бинарному делению, в результате которого клетки не распадаютс, а образуют псевдомицелий.

Для многих видов грибов может быть характерен диморфизм, то есть гифальная форма роста может переходить в дрожжеподобную, что чаще наблюдается в пораженных тканях человека (например, возбудители гистаплазмоза и бластомикоза).

Ни один из описанных выше морфологических элементов не является характерным для того или иного гриба. Комплексом разнообразных клеточных элементов определяется большой полиморфизм грибов в культурах на различных питательных средах. Тканевые формы грибов обычно представлены довольно однообразными спорами или мицелием, совсем не похожими на Культуральные элементы грибов.

Классификация грибов разработана недостаточно, в основе лежат морфоструктурная организация и способ размножения. Заболевания (микозы) у человека вызывают около 500 видов грибов. Их принято называть паразитическими, или патогенными, грибками.

Различают следующие классы, содержащие патогенные формы грибов:

1. Zygomycetes – зигомицеты. СМицелий не септированный, многоядерный. Имеют особый тип полового процессы – зигогамию, представляющую слияние недифференцированных на гаметы клеток. Образующая зигоспора покрывается толстой оболочкой и прорастает после периода покоя. Бесполое размножение осуществляется спорангиоспорами (эндоспоры) или конидиями (экзоспоры). Споры формируются в спорангиях на верхушке спороносцев. К порядку Mycorales к семейству Mucoraceae относится род Mucor (mucor mucedo), для которого характерны шаровидные спорангии. Споры гладкие, бесцветные или слабо окрашенные, яйцевидные. Конидии отсутствуют. Головчатая плесень может вызывать у человека поражение легких, среднего уха и общий инфекционный процесс.
2. Ascomycetes – аскомицеты. Сумчатые грибы с многоклеточным септированным мицелием. При половом процессе размножаются аскоспрорами (споры размножаются в особых сумках – асках). Бесполое размножение осуществляется конидиями. К порядку Pleotascales к семейству Aspergillaceae относится род Aspergillus (Aspergillus niger, Aspergillus flavus). Конидиеносцы прямостоящие, на концах шаровидное вздутие, несущее стеригмы, которые расположены радиально на поверхности своего вздутия (вид струек воды из лейки). «Леечная» плесень у человека вызывает аспергиллез легких, уха, глаз и др. органов и тканей. Род Penicillim («кистевик») имеет многоклеточные конидиеносцы, которые разветвляются в верхней части и заканчиваются стеригмами, расположенными в виде кисточек. От стеригм отшнуровываются конидии, одноклеточные, круглые или овальные, в массе часто зеленоватого цвета. Строение кисточки у различных видов пенициллов различно, оно положено в основу систематики рода
3. Класс Deuteromycetes (Fungi imperfecti) – несовершенные грибы, имеют многоклеточный мицелий. Бесполое размножение осуществляется конидиями или оидиями, образующимися в результате распада гиф на отдельные клетки. У некоторых дейтеромицетов конидии отсутствуют, и такие виды образуют склероции. Половой процесс отсутствует, весь жизненный цикл проходит в гаплоидной стадии. У некоторых видов установлена связь с аскомицетами и базидиомицетами. Особый интерес представляют возбудители дерматомикозов: фавус, трихофитии, эпидермофитии, микроспории.

К семейству Sacharomycetaceae относятся дрожжи (род Sacharomyces) и дрожжеподобные грибы (род Candida). Дрожжевые клетки имеют округлую, овальную или вытянутую форму размером 8 – 10 мкм, двухконтурную оболочку. В цитоплазме отмечаются включения в виде гранул гликогена, волютина, липидов. Размножение происходит почкованием и аскоспорами. Грибы Candida сходны с истинным дрожжами, отличием служит отсутствие аскоспор и способность к образованию всевдомицелия. При образовании псевдомицелия клетки вытягиваются в длину и соприкасаются узким основанием. Они вызывают кандидозы, которые развиваются у больных людей при резком снижении резистентности организма и длительном применении антибиотиков.

Кроме микозов, грибы могут вызывать микотоксикозы. В настоящее время изучено около 300 видов микотоксинов (афлотоксин, охратоксин, мускарин, лизергиновая кислота и др.). микотоксины вызывают у человека сильные пищевые отравления, острые гепатиты, они обладают нефротоксичностью, многие из них канцерогенны и тератогенны.

В микробиологической промышленности грибы используются как продуценты органических кислот (лимонной Aspergillus niger), ферментов (амилаз – Aspergillus oryzae, пектиназ – Aspergillus awanori, каталазы – Penicillium vitale и др.), липидов, антибиотиков (пениуиллина – Penicillium notatum, гризеофульвина – Penicillium griseofulvum), а также в пищевой промышленности (например, созревание сыров рокфор и камамбер, получения вина, спирта, при хлебопечении и т.д.).

Методы исследования. Для микроскопического исследования готовят как неокрашенные (нативные), так и окрашенные препараты.

Исследование неокрашенных препаратов.

Чтобы яснее различить элементы грибка, производят просветление препарата. Для этого патологические материал (корочки, кусочки ногтя, волос, соскобы со слизистой, содержимое гранулематозных очагов) помещают на часовое стекло или чашку Петри, куда наливают 10 – 15% раствор едкого натрия или калия и ставят в термостат при 37˚С на 20 – 30 мин. Затем материал извлекают и помещают в каплю 50% раствора глицерина на предметное стекло и закрывают покровным стеклом, исследуют в фазово-контрастном или световом микроскопе. Можно использовать другой метод – на патологический материал наносят каплю глицерина с добавлением 10% едкого калия и микроскопируют 4-5 мин., закрыв покровным стеклом.

Гной из абсцессов, содержимое язв, мокроту разбавляют физиологическим раствором, или водно-спиртовым (1:1), или 50% водным раствором глицерина, готовят препарат «раздавленная капля» и рассматривают при увеличении х200, х400, используя фазовый контраст.

Исследование окрашенных препаратов.

Из гноя, крови, ликвора, осадка бронхиальных смывов и мочи готовят тонки мазки, которые фиксируют в смеси Никифорова, Карнуа, спирт-формоле, высушивают и окрашивают.

Окраска лактофуксином, содержащим кислого фуксина 0,1г, молочной кислоты – 100мл. Окрашивают в течение 3 – 5 мин. Фон препарата розовый, мицелий опалесцируют голубым цветом. Хорошо окрашиваются грибы при мукормикозе и аспергиллезе.

Окраска лактофенолом. Мазок заливают на 30 – 60 мин смесью, содержащей 2 части глицерина и по 1 части карболовой, молочной кислот и дистиллированной воды. При добавлении 5% раствора синьки грибки окрашиваются в голубой цвет. При этом мазки фиксируются и окрашиваются одновременно.

Окраска по Романовскоми – Гимзе. Краску, разведенную в дистиллированной воде (1-2 капли краски на 1 мл. воды), наносят на фиксированный смесью Никифорова мазок и оставляют на 30 – 60 мин. Промывают водой и высушивают. Окраску применяют при исследовании возбудителей кандидомикоза, гистолпазмоза, криптококкоза. Дрожжевидные клетки окрашиваются в розово-фиолетовый цвет, хроматиновые включения - в красный, волютин – в фиолетовый.

Кроме того, мазки можно окрашивать по Цилю – Нельсону (модификация Раусона), 1% водным раствором метиленового синего, гематоксилин – эозином. Для изучения грибков в тканях проводится патогистологические исследование. Для этого готовят парафиновые или целлоидиновые срезы (толщиной 1-3 мкм), которые окрашивают, обезвоживают, просветляют и заключают в канадский бальзам.

Простейшие.

Простейшие – одноклеточные эукариоты, близкие по строению к клеткам сложно организованных животных. Это целостный организм, выполняющий все функции, которые свойственны живым существам. Большинство простейших имеет размеры от 30 до 150 мкм. Форма может быть грушевидной (трихомонады, лямблии), яйцевидной (балантидий), веретенообразной (трипаносомы, лейшмании), могут принимать самую причудливую конфигурацию (амебы). Клетки простейших, как у всех эукариот, содержат ядро (иногда несколько), цитоплазму, мембрану (оболочку), чего образуется пелликула. Кроме органелл общего значения (рибосомы, митохондрии, лизосомы, эндоплазматическая сеть, аппарат Гольджи), имеются специфические органеллы. Так, у лямблий это две эластичные нити – аксостиль и присасывательный диск, у трихомонад и трипаносом – ундулирующая мембрана, у токсоплазм – коноид и система микротрубочек, у балантидия – подобие ротовой полости (цитостом) и анальная пора (цитопрокт), сократительные вакуоли, микронуклеус.

Большинство простейших подвижно и движение осуществляется с помощью псевдоподий (амебы, малярийный плазмодий), жгутиков (лямблии, лейшмании), ресничек (балантидий).

Псевдоподий – временные выпячивания цитоплазмы, выпуская их, простейшие все время меняют форму тела.

Жгутики – длинные тонкие выросты, состоящие из 11 фибрилл, из которых 2 центральные и 9 периферические.

Реснички – по строении. Сходны со жгутиками, но в отличие от них, короткие и работают наподобие весел.

Простейшим свойственны определенные жизненные циклы, во время которых при неблагоприятных условиях вегетативные формы превращаются в цисты. Простейшие округляются, теряет подвижность и покрывается плотной двухконтурной оболочкой. Особенности формы и строение цисты имеют важное диагностическое значение. Так, зрелая форма дизентерийной амебы имеет размер 8-14 мкм, округлую форму и 4 ядра, цисты лямблий овальные и четырехядерные, в них виден аксостиль со жгутиками, у балантидия цисты крупные – 30-60 мкм, овальные, с бобовидным ядром. Простейшие относятся к царству Protozoa (protos – первый, zoa – животное). Медицинское значение имеют:

1. Тип Sarcomastigophora, подтип Sarcodina (саркодовые). Тело их лишено пелликулы, передвигаются с помощью псевдоподий. К этому классу относятся различные виды амеб, в том числе дизентерийную амебу (Entomaeba histolyca).
2. Тип Sarcomastigophora, подтип Mastigohora (жгутиконосцы). Имеют тонкую пелликулу и снабжены жгутиками для передвижения. Из паразитических простейших в этот подтип входят трипаносомы (Trypanosoma gambiense), лямблии (Giardia lamblia), лешмании (Leishmania donovani, Leishmania tropica), вызывающие соответственно африканскую сонную болезнь, лямблиоз, лейшманиоз.
3. Тип Ciliophora (реснитчатые, инфузории). Тело покрыто пелликулой со множеством коротких ресничек, при помощи которых инфузории передвигаются. Паразитическим представителем этого класса является балантидий (Balantidium coli), вызывающий балантидиоз.
4. Тип Apicomplexa, класс Sporozoa (споровики). Класс состоит исключительно из паразитических простейших. Передвигаются они при помощи псевдоподий или жгутиков. Последние образуются при половом размножении у микрогамет отрядов гемоспоридий и кокцидий. В состав класса входят 4 вида малярийных плазмодиев (Plasmodium vivax, malariae, ovale, fallciparum), вызывающих малярию, токсоплазма (Toxoplasma gondii), вызывающая токсоплазмоз.

Методы исследования.

Для изучения простейших готовят временные (нативные) и постоянные (окрашенные) препараты. Нативные препараты готовят методом «раздавленной капли» либо «висячей капли» с добавлением теплого физиологического раствора или витальных прижизненных красителей: трипанового синего (разведение 1:5000), нейтрального красного (разведение 1:200000). При микроскопии нативных препаратов обращают внимание на форму, особенности движения простейших, наличие включений, при этом используется малое (х8) или большое увеличение (х40) светопольное или фазово-контрастного микроскопов.

Наряду с этим из патологического материала (фекалий, отделяемое язв, пунктат костного мозга, селезенки, печени, материал дуоденального зондирования, выделения мочеполовых путей, крови) делаю тонкие мазки. Из крови готовят препарат «толстая капля». Для этого палец, обработанный эфиром, поворачивают проколом вниз и к выступающим каплям подносят предметное стекло, на которое берут 2-3 капли крови, и затем иглой или углом другого предметного стекла кровь распределяют. Чтоб получить овал около 1см, для ускорения высыхания препарата можно поместить в термостат при 35-37˚С

Из внутренних органов готовят мазки – отпечатки. Препараты фиксируют метиловым спиртом или смесью спирт – эфир (1:1) и окрашивают по Романовскому – Гимзе, железным гемотоксилином по Гейденгану или 1% метиленовым синим. При окраске по Романовскому – Гимзе цитоплазма паразита окрашивается в голубой цвет, ядро и жгутики – в красновато-фиолетовый. При использовании железного гематоксилина по Гейденгайну цитоплазма красится в серовато-голубой, а ядерные структуры простейших – в черный цвет.

Для обнаружения цист применяют крепкий раствор Люголя, окрашивающий структуры цист в темно-коричневый цвет.

Окраска железным гематоксилином по Гейденгайну:

1. Мазки после фиксации помещают в 2,5% раствор железоаммиачных квасцов на 1ч.
2. После трехкратного ополаскивания в воде окрашивают красителем (0,5г. гематоксилина, 10мл 96% спирта и после растворения добавляют 90мл дистиллированной воды) в течение 5-10мин.
3. Промывают водой и высушивают.

Окраска незаменима в тех случаях, когда нужно выявить тончайшие детали строения ядра и цитоплазмы простейших.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ К ЗАЧЕТУ

ПО ТЕМЕ «МОРФОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ»

1. Предмет, задачи и история развития микробиологии (этапы). Открытия А. ван Левенгука, Луи Пастера, Роберта Коха и Александра Флеминга.
2. Рол отечественных ученых в развитии микробиологии.
3. Классификация, таксономия и номенклатура микроорганизмов. Бинарная номенклатура.
4. Морфологические формы истинных бактерий.
5. Морфология актиномицетов, спирохет, риккетсий, хламидий, микоплазм.
6. L-форма бактерий. Их отличие от микоплазм.
7. Структура и функции прокариотической клетки: обязательные и необязательные структуры.
8. Особенности строения клеточной стенки Грам+ и Грам- бактерий.
9. Морфо-функциональные отличия эукариотической и прокариотической клеток. Структура эукариотической клетки.
10. Классификация и морфология грибов. Методы исследования.
11. Классификация и морфология простейших. Методы исследования.
12. Классификация, морфология и ультраструктура вирусов. Методы исследования.
13. Взаимодействие вируса с клеткой. Этапы, типы инфекции. Вирогения, персистенция вируса.
14. Классификация, морфология и ультраструктура бактериофагов.
15. Взаимодействие бактериофага с клеткой. Вирулентные и умеренные фаги. Лизогения, фаговая конверсия.
16. Правила работы в микробиологической лаборатории.
17. Устройство микроскопа. Особенности работы с иммерсионной системой.
18. Фазовоконтраснтая, темнопольная, электронная, люминесцентная микроскопия.
19. Техника приготовления мазка – препарата. Простые методы окрашивания: методы Грамма, Циля – Нильсена, Ожешко, Бури – Гинса, Нейсера, Леффлера, Романовского – Гимзе.

Поиск по сайту: