В бактериологической лаборатории

Общего назначения.

• В помещение лаборатории нельзя входить без специальной одежды – халат, шапочки, сменной обуви.
• Запрещается в помещении прием и хранение пищи, курение.
• Нельзя использовать лабораторную спецодежду за пределами лаборатории.
• Зараженный материал подлежит уничтожению, инструменты и поверхность рабочего стола дезинфицируют после окончания работ.
• После работы с культурой, животными перед уходом из лаборатории необходимо вымыть руки.
• Необходимо проводить обеззараживание предметов, одежды, стола, комнаты в случае, если разбился сосуд с инфицированным материалом или произошел неосторожный разлив заразного материала.
• В лаборатории должна быть инструкция по технике безопасности, которую персонал должен знать и строго выполнять. Необходимо немедленно сообщать руководителю лаборатории обо всех аварийных ситуациях, создающих угрозу биологической безопасности, и проводить все мероприятия для предотвращения последствий.

СТРУКТУРА БАКТЕРИАЛЬНОЙ КЛЕТКИ

И МЕТОДЫ ЕЁ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Бактерии являются прокариотами и существенно отличаются от клеток растений и животных (эукариотов). Они относятся к одноклеточным организмам и состоят из клеточной стенки, цитоплазматической мембраны, цитоплазмы, нуклеоида (обязательных компонентов бактериальной клетки). Некоторые бактерии могут иметь жгутики, капсулы, споры, пили (необязательные компоненты бактериальной клетки).

Клеточная стенка

Клеточная стенка представляет собой внешнюю структуру бактерий толщиной 30-35нм, главным компонентом которой является пептидогликан (муреин). Пептидогликан – это структурный полимер, состоящий из чередующихся субъединиц N-ацетилглюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты, соединенных гликозидными связями.

Параллельно расположенные полисахаридные (гликановые) цепи скреплены между собой поперечными пептидными мостиками.

Полипептидный каркас легко разрушается лизоцимом – антибиотиком животного происхождения. Пептидные связи являются мишенью для пенициллина, который ингибирует их синтез и препятствует формированию клеточной стенки. Количественное содержание пептидогликана влияет на способность бактерий окрашиваться по Грамму. Бактерии, имеющие значительную толщину муреинового слоя (90-95%), стойко окрашивается генцианвиолетом в сине-фиолетовый цвет и носят название грамположительных бактерий. Грамотрицательные бактерии с тонким слоем пептидогликана (5-10%) в клеточной стенке после действия спирта утрачивают генцианвиолет и дополнительно окрашиваются фуксином в розовый цвет. Клеточные стенки у грамположительных и грамотрицательных прокариот резко различаются как по химическому составу (табл.1), так и по ультраструктуре.

Кроме пептидогликана, в клеточной стенке грамположительных бактерий содержатся тейхоевые кислоты (ТК), в меньшем количестве липиды, полисахариды, белки.

ТК (полифосфатные соединения) делят на два класса: 1) стеночные, связанные с пептидогликаном клеточной стенки, 2) мембранные (липотейховые), соединенные с гликопептидом цитоплазматической мембраны. ТК могут связываться с клеточными мембранами животных клеток и осуществлять процесс адгезии, необходимый для бактериальной колонизации, которая является первой стадией большинства инфекций. Особый интерес представляет изучение явления индукции тейхоевыми кислотами воспалительных процессов, цитотоксичности и иммуносупрессии.

Таблица 1

Химический состав клеточных стенок

Грамположительных и грамотрицательных

Прокариот.

На поверхности клеточной стенки грамположительных бактерий могут присутствовать белковые молекулы, не образующие структур определенной формы (белок А стафилококков, М-протеин стрептококков). Они обладают высокой биологической активностью, вызывают агглютинацию эритроцитов, являются иммунодепрессантами, угнетают фагоцитоз, комплемент, препятствуют трансформации лимфоцитов, способствуют адгезии бактерий на клетках эпителия слизистых оболочек.

Грамотрицательные прокариоты имеют наружную мембрану, в состав которой входят липиды (22%), белки, полисахариды, липопротеиды.

Липополисахариды (ЛПС) – гетерополимеры с комплексной структурой, обладающие разнообразной биологической активностью. Липоидный комплекс обуславливает токсичность (воспалительные реакции, лихорадка, эндотоксиновый шок), полисахаридный компонент ответственен за О-антигенспецифичность. ЛПС индуцирует синтез М-антител, в иммунологии используется в качестве адъюванта и поликлонального активатора В-клеток.

Клеточная стенка у бактерий выполняет в основном формообразующую и защитную функции, обеспечивает ригидность, формирует капсулу, определяет способность клеток к адсорбции фагов.

Формы бактерий.

Всем бактериям присущи определенные морфологические свойства (форма, размер, характер их расположения в мазке) и тинкориальные свойства (способность окрашиваться).

Различают 3 основные формы бактерий: шаровидные (сферические или кокки), палочковидные (цилиндрические или палочки) и извитые (спиралевидные) бактерии.

Шаровидные бактерии в зависимости от расположения подразделяются на микрококки (расположенные беспорядочно), диплококки (парное расположение), стрептококки (расположенные цепочками), стафилококки (гроздевидные) и сарцины (формирующие пакеты).

Палочковидные бактерии располагаются часто беспорядочно (эшерихии), попарно (клебсиеллы), под углом (коринебактерии дифтерии), цепочками (возбудитель сибирской язвы). Концы палочек могут быть закругленными, заостренными, утолщенными или обрубленными.

Извитые бактерии могут быть в виде запятой (холерный вибрион), спиралей с одним – тремя витками (спириллы) и тонких нитей с большим количеством завитков (спирохет).

Для изучения тинкториальных свойств микроорганизмов и их морфологии используют анилиновые красители (основные, кислые и нейтральные).

Наибольшее применение имеют основные краски: метиленовый синий, основной фуксин, генцианвиолет и др. ИЗ названных красок готовят спиртовые, вводно-спиртовые и водные растворы. В некоторых случаях для повышения красящей силы раствора к нему добавляют карболовую кислоту (карболовый фуксин Циля) или щелочь.

Для определения формы бактерий и их взаимного расположения в мазке используют простые методы окраски, т.е. окраска осуществляется одним красителем (фуксином 1-2мин. Или метиленовым синим 3-5мин.), и мазок получается окрашенным одним цветом. Например, для выявления в мазке гонококков используют метиленовый синий. Эта окраска позволяет лучше выявить бобовидную форму и парное расположение кокков.

Для изучения структуры бактериальной клетки и выявления особенностей ее строения применяют сложные методы окраски. Которые включают в себя целый ряд (2 и белее) красящих и дифференцирующих веществ. К сложным методам окраски относятся методы Грама, Нейссера, Ожешко, Бури-Гинса, Циля-Нильсена и др.

Методика окраски по методу Грамма.

1. На мазок кладут фильтровальную бумагу и наливают карболовой раствор генцианового фиолетового на 1-2 мин.
2. Снимают бумагу, сливают краситель и, не промывая мазок водой, наливают раствор Люголя на 1мин.
3. Сливают раствор Люголя и обесцвечивают препарат в 96% спирте в течение 30с.
4. Промывают водой.
5. Красят 1-2 мин. Водным раствором фуксина.
6. Промывают водой и высушивают.

В результате грамположительные бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет, грамотрицательные – в красный.

Для микобактерий, нокардий и актиномицетов характерна усложненная структура клеточной стенки. Основу у них, так же как и у грамположительных бактерий, составляет муреиновый каркас, однако последний связан с полисахаридами и липидами. Липиды представлены миколовыми кислотами, которые придают клеточной поверхности гидрофобность. Гидрофобность, с одной стороны, делает клетку устойчивой к действию различных химических веществ (такие бактерии называются кислотоустойчивыми), с другой – тормозит обмен клетки с окружающей средой и замедляет ее рост. Поэтому в питательные среды для культивирования микобактерий туберкулеза добавляют поверхностно – активные вещества. Кислотоустойчивость микобактерий является важным диагностическим признаком, для ее определения пользуется окраской по Цилю-Нильсену.

Методика окраски кислотоустойчивых бактерий по Цилю-Нильсену.

1. На фиксированной мазок помещают фильтровальную бумагу, наливают карболовый фуксин Циля и осторожно нагревают на горелке до появления паров. Операцию повторяют 2-3 раза.
2. Когда препарат остынет, снимают фильтровальную бумагу, сливают краситель и промывают препарат водой.
3. Препарат погружают 2-3 раза в стакан с 5% серной кислотой на 1-2с.
4. Тщательно промывают препарат теплой водой и докрашивают щелочным метиленовым синим 3-5 мин.
5. Промывают водой и подслушивают.

Кислотоустойчивые бактерии не обеспечиваются серной кислотой и сохраняют красный цвет, некислотоустойчивые теряют краситель и докрашиваются метиленовым синим в голубой цвет.

Поиск по сайту: