Качественная реакция на желчные кислоты

Лабораторная работа

Количественное определение макроэргических соединений

В мышцах (АТФ и креатинфосфат)

В мышечной ткани содержится два макроэргических соединения: АТФ и креатинфосфат. Они обеспечивают мышцу по мере надобности большим количеством энергии.

Основной путь образования АТФ в тканях – окислительное фосфорилирование в процессе тканевого дыхания. Креатинфосфат образуется при участии АТФ в состоянии покоя и служит резервом высокоэргического фосфата для синтеза АТФ из AДФ при активной мышечной работе.

Принцип метода. Метод определения макроэргических соединений в мышцах основан на том, что два последних остатка фосфорной кислоты в АТФ, богатые энергией, как и фосфатный остаток в креатинфосфате, легко отщепляются при непродолжительном гидролизе в кислой среде (так называемый лабильно связанный фосфор). Сравнение содержания неорганического фосфора в пробах до и после гидролиза дает представление о количестве лабильно связанного фосфора, которое приходится на долю макроэргических соединений мышечной ткани. Количество фосфора определяют по цветной реакции с молибдатом аммония в присутствии аскорбиновой кислоты.

Ход работы. Тщательно измельченную мышечную кашицу в количестве 5 г помещают в мерную колбу на 100 мл, стоящую на ледяной бане, и добавляют в нее 50 мл охлажденного 2,5%-ного раствора ТХУ. Содержимое пробирки активно перемешивают для экстрагирования АТФ и креатинфосфата в течение 5 мин. Экстракт фильтруют в мерную колбу на 100 мл, стоящую на ледяной бане. К остатку мышечной кашицы приливают 40 мл дистиллированной воды и продолжают экстракцию на холоде в течение 5 минут. Полученный водный экстракт после фильтрования добавляют к экстракту с ТХУ, доводя общий объем до 100 мл дистиллированной водой.

В две термостойкие колбы – контрольную и опытную – с помощью пипетки Мора наливают по 5 мл полученного безбелкового фильтрата. В опытную колбу добавляют 10 мл 1 М НСl, закрывают пробкой и помещают на кипящую водяную баню на 10 мин для гидролиза фосфорных связей. Затем раствор охлаждают и добавляют 10 мл 1 М NaOH.

В контрольную колбу (без предварительного кипячения) добавляют 10 мл 1 М НСl и 10 мл 1 М NaOH. Затем в обе колбы добавляют по 75 мл дистиллированной воды (до получения объема 100 мл).

Дальнейшие процедуры проводят обязательно одновременно. Из обеих колб отбирают по 50 мл жидкости, переносят в две мерные колбы на 100 мл и добавляют в каждую из них по 5 мл 1%-ного раствора молибдата аммония, 5 мл 1%-ного раствора аскорбиновой кислоты и дистиллированную воду до метки. Смесь в каждой колбе быстро перемешивают и оставляют стоять при комнатной температуре строго в течение 30 минут.

Контрольную и опытную пробы колориметрируют на ФЭКе с красным светофильтром (длина волны 670 нм) в кюветах с толщиной слоя 1,0 см против воды. В опытной пробе (после гидролиза) определяемый неорганический фосфат представляет собой сумму лабильно связанного фосфора и солей фосфата, присутствующих в тканях. В контрольной пробе определяются только фосфатные соли.

Из оптической плотности, найденной для опытной пробы, вычитают оптическую плотность, полученную для контрольной пробы. Концентрацию лабильно связанного неорганического фосфата в пробе находят по калибровочному графику, используя в качестве стандарта раствор KH₂PO₄. Рассчитывают количество лабильно связанного фосфора в миллиграммах на 100 г сырой массы, учитывая разведение. Производят пересчет данных на содержание АТФ и сравнивают полученное значение с известными з литературных источников.

Лабораторная работа

Химия и обмен липидов

Жиры и липоиды подвергаются гидролитическому расщеплению в пищеварительном тракте. Нейтральные жиры распадаются на глицерин и жирные кислоты; фосфатиды (лецитины, кефалины, серинфосфатиды и др.) расщепляются на глицерин, жирные кислоты, фосфорную кислоту и азотистые основания — холин, коламин (этаноламин), серин и т. д. При гидролизе стеридов освобождаются холестерин или эргостерин и жирные кислоты.

Гидролитический распад жиров катализируется ферментами липазами, которые содержатся в соке желудка, поджелудочной железы и тонкого кишечника.

Роль желудочной липазы у взрослого человека весьма невелика, так как фермент катализирует расщепление лишь тонкодиспергированных, предварительно эмульгированных жиров (например, молочного). Значительная роль в переваривании жиров принадлежит липазе поджелудочной железы. Расщепление жиров происходит главным образом в тонком кишечнике.

Липаза поджелудочной железы выделяется в малоактивной форме и активируется желчными кислотами. Значение желчных кислот в переваривании жира очень велико. Они являются не только активаторами липазы. Будучи поверхностно-активными веществами, желчные кислоты способствуют эмульгированию жиров, что увеличивает во много раз их поверхность соприкосновения с водным раствором липазы.

Липазы содержатся также в растительных объектах (семенах злаков, масличных растений) и микроорганизмах. При их участии происходит порча круп, муки и других продуктов при хранении.

Гидролитическое расщепление жиров протекает в несколько стадий. Липаза действует главным образом на внешние (α) эфирные связи молекулы триглицерида. Вначале отщепляются жирные кислоты, связанные с глицерином в α-положении, и образуется глицерин-2-жирная кислота, которая затем изомеризуется в глицерин-1-жирную кислоту, подвергающуюся уже окончательному расщеплению.

Продукты гидролитического расщепления жиров всасываются в тонком кишечнике. Глицерин растворим в воде и всасывается легко. Жирные кислоты образуют растворимые комплексные соединения с желчными кислотами (так называемые холеиновые кислоты), которые также всасываются в кишечнике. Холеиновые кислоты затем расщепляются на свои компоненты в клетках эпителия кишечных ворсинок. Освободившиеся желчные кислоты всасываются в кровь и через систему воротной вены снова поступают в печень. Жирные же кислоты вступают в сложноэфирную связь с глицерином, образуя жир, свойственный уже данному виду животного.

Гидролиз фосфолипидов катализируется ферментами фосфолипазами (А, В, С, D), расщепление холестеридов происходит под влиянием холестеролэстеразы.

Качественная реакция на желчные кислоты

Желчные кислоты по своему строению близки к холестерину и являются производными холановой кислоты:

Холановая кислота

Желчные кислоты (холевая, дезоксихолевая, литохолевая) входят в состав желчи как в чистом виде, так и в виде парных соединений с гликоколлом (глицином) и таурином (с которыми они соединяются посредством пептидной ковалентной связи).

Для открытия желчных кислот используют их способность давать красное окрашивание с оксиметилфурфуролом (реакция Петтенкофера). Оксиметилфурфурол образуется при реакции фруктозы с концентрированной соляной или серной кислотой.

Выполнение опыта

В сухую пробирку наливают 10 капель водного раствора желчи (желчь:вода=1:2), добавляют 1—2 капли 5%-ного раствора сахарозы и, наклонив пробирку, осторожно (по стенке) наслаивают равный объем концентрированной серной кислоты. На границе слоев образуется пурпурное кольцо, которое затем принимает красно-фиолетовое окрашивание.

Поиск по сайту: