Принципы постановки непрямого метода ИФА

Предварительно приготовленный согласно инструкции, прилагаемой к набору, исследуемый материал (сыворотка, плазма) вносится в лунку планшета. Если этого требует методика, планшет предварительно отмывается. Несколько лунок планшета заполняются контрольными сыворотками, содержащими и не содержащими антитела к ВИЧ. При работе с контрольными сыворотками необходимо строго соблюдать инструкции по применению диагностической тест-системы, т.к. интерпретация результатов зависит от значений оптической плотности контрольных сывороток. Планшет с внесенными контрольными сыворотками и исследуемым материалом инкубируется при условиях, указанных в инструкции, прилагаемой к диагностическому набору. Если специфические антитела присутствуют в сыворотке, они образуют комплекс с антигеном, сортированным на поверхности лунок планшета. Несвязавшиеся с антигеном антитела удаляются при отмывке планшета.

Затем во все лунки планшета вносят конъюгат-антитела против иммуноглобулинов человека, меченые ферментом (пероксидаза, щелочная фосфатаза и др.). При последующей инкубации происходит образование комплекса антиген-антитело-конъюгат. Несвязавшийся конъюгат удаляется во время отмывки планшета. Наиболее широко применяемым индикаторным ферментом для ИФА является пероксидаза хрена. Субстратом для нее является перекись водорода.

Эта реакция протекает без видимых проявлений. Изменение окраски раствора происходит при окислении красителей (ортофенилендиамина или др.), который входит в состав субстратного раствора.

Краситель из восстановленной формы переходит в окисленную окрашенную форму. Таким образом, происходит окрашивание только тех лунок, в которых присутствует комплекс антиген-антитело-конъюгат. Иногда окрашивание может быть результатом неспецифического связывания иммуноглобулинов с антигенами ВИЧ. Учет реакции проводят на спектрофотометре (ридере) при длине волны, указанной в инструкции, прилагаемой к диагностическому набору. Длина волны зависит от красителя, используемого в тест-системе.

Принцип постановки конкурентного метода ИФА

При конкурентном методе ИФА в лунки планшета с нанесенным антигеном одновременно вносятся исследуемые сыворотки и конъюгат. Конъюгат в данном случае - это антитела против ВИЧ, меченые ферментом. При последующей инкубации антитела, содержащиеся в сыворотке, и конъюгат вступают в конкурентное взаимодействие с иммобилизованными на твердом носителе антигеном. Если сыворотка содержит антитела, они взаимодействуют с антигеном, блокируя образование комплекса антиген-коньюгат. При отсутствии антител в сыворотке происходит образование комплекса антиген-коньюгат. Оставшиеся несвязанными компоненты после инкубации отмываются и в систему добавляется соответствующий субстрат. При наличии антител в сыворотке цветная реакция не развивается.

Таблица 1. Возможные ошибки при проведении ИФА

При постановке ИФА в случае получения положительного результата анализ проводится еще 2 раза (с той же сывороткой). При получении хотя бы еще одного положительного результата сыворотка направляется в референс-лабораторию.

Иммунный блотинг

В настоящее время для подтверждения специфичности первичного положительного результата чаще всего используется метод иммунного блотинга - Westen blot. Принцип метода заключается в выявлении антител к определенным белкам вируса, иммобилизованным на нитроцеллюлозную мембрану. В организме человека образуются антитела к ряду компонентов вируса, данные об этих антигенах приводятся в таблице.

Таблица 2

Примечание: молекулярный вес белков выражается в килодальтонах - кд, гп - гликопротеины, п - протеины.

Подготовка нитроцеллюлозных мембран для тест-системы производится следующим образом. На первом этапе производят разделение белков вируса иммунодефицита человека по молекулярному весу с помощью электорфореза в полиакриламидном геле. Белки мигрируют в слоях геля при наложении электрического потенциала: белки с низким молекулярным весом проходят через поры в полиакриламидном геле легче, чем белки с высоким молекулярным весом и быстрее достигают конца геля. В результате этого происходит разделение белков на отдельные полосы по молекулярному весу. Затем осуществляется электрофоретический перенос из полиакриламидного геля на поверхность нитроцеллюлозной мембраны. После этого мембрана обрабатывается блокирующим раствором во избежание неспецифического связывания иммуноглобулинов сыворотки крови, затем отмывается, высушивается и разрезается на отдельные полоски, которые вкладываются в набор. Перенесенные таким образом белки выявляются на нитроцеллюлозной реплике (блоте) с помощью непрямого анализа, а именно: сыворотка или плазма инкубируются с блотом: если исследуемый материал содержит антитела к белкам ВИЧ, они связываются с антигеном, перенесенным на нитроцеллюлозную мембрану, после отмывки полоски блота инкубируются с конъюгатом: при образовании комплекса антиген-антитело, конъюгат присоединяется к нему, после отмывки от конъюгата и инкубации с субстратом происходит окрашивание тех участков нитроцеллюлозы, где произошло образование комплекса антиген-антитело-коьюгат. Полученный результат сравнивается с результатами тестирования положительной и отрицательной контрольных сывороток.

Результаты, полученные в иммунном блоттинге интерпретируются как положительные, сомнительные и отрицательные.

Таблица 3 Рекомендуемые критерии оценки результатов иммунного блоттинга

Примечание: Рекомендации Российского центра учитывают опыт работы с сыворотками детей из внутрибольничных очагов, у которых часто определялись антитела только к одному из белков оболочки вируса. Своевременная постановка диагноза у таких детей позволила быстро начать противоэпидемические мероприятия и специфическую терапию. Вопросы стандартизации и интерпретации результатов иммунного блоттинга были рассмотрены на совещании экспертов ВОЗ в Женеве 22-23 апреля 1990 г.

Согласно этим рекомендациям при наличии реакции только из белков оболочки (гп 160, гп 120. гп 41) в сочетании или без реакции с другими белками результат считается сомнительным и рекомендуется повторное исследование, с использованием набора другой серии или другой фирмы. Если и после этого результат остается сомнительным, рекомендуется наблюдение в течение 6 месяцев (через 3 месяца). Наличие положительной реакции с п.24 может указывать на период сероконверсии. В этом случае рекомендуется, в зависимости от клинических и эпидемиологических данных, повторить исследование с образцом сыворотки, взятым через 2 недели.

Положительные реакции с белками gag и pol без наличия реакции с белками env могут отражать стадию ранней сероконверсии, либо указывать на ВИЧ-2 инфекцию или на неспецифическую реакцию. Лица с такими результатами после тестирования на ВИЧ-2 должны повторно исследоваться через 3 месяца (в течение 6 месяцев). Если через 6 месяцев вновь будут получены неопределенные результаты (отсутствие реакции с белками env ВИЧ-1 и ВИЧ-2), а также не будут выявлены факторы риска и клинические симптомы иммунодефицита, можно сделать вывод о неспецифической реакции. Наличие неспецифической реакции не дает основания для постановки диагноза ВИЧ-инфекции, но доноров, имеющих такой результат, от донорства необходимо отстранить. Результаты серологических исследований используются эпидемиологами и практическими врачами для ранней диагностики ВИЧ-инфекции, своевременного выявления источника инфекции, скорейшего проведения противоэпидемических мероприятий и оказания помощи зараженным лицам. На основании только лабораторного анализа диагноз не может быть выставлен. Для вынесения диагностического заключения необходимо учитывать данные эпидемиологического анамнеза, иммунологических тестов и результатов клинического обследования.

Поиск по сайту: