Умови культивування мікробів для приготування вакцин

Асоційована коклюшно – дифтерійно – правцева вакцина

ПЛАН

1. Загальна характеристика АКДП вакцини.

2. Технологія виготовлення коклюшної суспензії.

3. Методика приготування середовища казеїново- вугільного агару (КВА).

4. Умови культивування мікробів для приготування вакцин.

5. Технологія виготовлення АКДП вакцини.

6. Контроль вакцини.

1.Адсорбовану коклюшно – дифтерійно – правцева вакцина (АКДП вакцину) в Радянському Союзі почали застосовувати з 1960р., а в 1964-1965рр. нею повністю замінили коклюшно – дифтерійну (КД) і коклюшно – дифтерійно – правцева вакцини (КДП), які випускались раніше. АКДП вакцина за ефективністю рівноцінна цим препаратам, але значно менше реактогенна ( в ній вдвічі зменшено кількість мікробів і антигенних одиниць анатоксинів ).

АКДП вакцини, які випускаються в різних країнах, відрізняються за сметодами виготовлення, кількісному вмісту в них окремих антигенів та їх якісній характеристиці, що визначає відмінності в реактогенності й ефективності вакцинації.

АКДП вакцина випускається в рідкому вигляді, напівпрозорій рівномірно мутній білуватого кольору рідині.

В 1мл рідкої АКДП вакцини міститься 20 одиниць мутності (МЕМ)¹ вбитих коклюшних мікробів (за стандартом ГІСК ім. Л.А.Тарасевича), 30 ЛФ дифтерійного і 10 ЕС правцевого, очищених і концентрованих анатоксинів, не більше 2мг Al₂O₃ (у вигляді Al(OН)₃ ) і 100+20мкг мертіолату (тіомерсалу).

Для виготовлення АКДП вакцини необхідно мати наступні види спечифічної сировини (напівфабрикати): суспензію коклюшних мікробів, очищені концентровані дифтерійний і правцевий анатоксини, гель гідроксиду алюмінію.

2.Технологія виготовлення коклюшної суспензії.Характеристика і зберігання штамів. Для виготовлення суспензії із коклюшних мікробів (вакцини) використовують штами В.pertussis. За морфологією мікроби – нерухомі, грам-негативні, овоїдної форми палички, які розміщуються в мазках окремо або парами. На щільних середовищах колонії випуклі, круглі, з рівними краями, блискучі, напівпрозорі, діаметром близько 1мм.

Виробничі штами зберігають в ліофілізованому стані при температурі 3-10⁰С. Тривалість зберігання не більше 5 років з обов'язковою щорічною перевіркою перед використанням їх властивостей за всіма показниками.

¹ 1 МЕМ приблизно дорівнює 1млрд коклюшних мікробів

Виготовлення сухих культур. Культуру вирощують на казеїново – вугільному агарі з 5% крові людини або середовищі Борде-Жангу.

Приготування суспензій для висушування. Вміст ампули з сухою культурою розчиняють в 0,5мл стерильної дистильованої води або казеїнового гідролізату, засівають на 2 пробірки з вказаними середовищами. Витримують їх в рефрижераторі 18-20год при 4⁰С і в нахиленому положенні 2 дні при 35-36⁰С. Потім культуру пересівають на необхідну для приготування суспензії кількість пробірок і вирощують 20год. Культуру знімають скляною петлею і готують суспензію густиною 30-50 МЕМ/мл на стерильному розчині, який складається з дистильованої води з 10% сахарози і 1% желатину (рН 7,0 – 7,1). Деякі автори пропонують додавати до цього середовища 0,5% тіосечовини або 5% глутамату натрію. В якості середовища висушування можна використовувати також стерильне молоко.

Суспензію перевіряють на чистоту (перегляд мазків і посівів) і не пізніше, ніж через 1год після змиву розливають в ампули приблизно по 0,2 – 0,5мл і висушують із замороженого стану при звичайному режимі.

Кожну серію ліофілізованої культури перевіряють на виживання, чистоту, морфологію, культуральні, серологічні, токсичні, захисні властивості. На кожній ампулі обов'язково вказують номер культури, порядковий номер і дату ліофілізації. Після відновлення культуру підтримують пересівами (кожні 7 – 10 днів) на тих же середовищах. Зберігають культуру при температурі 4-10⁰С.

3. Методика приготування середовища казеїново- вугільного агару (КВА).До складу середовища КВА входять: гідролізат казеїну, діалізат дріжджів, мінеральні солі, розчинний крохмаль, хлорид цистеїну, активоване вугілля і агар-агар.

Гідролізат казеїну. Гідроліз проводять соляною кислотою під тиском. На 2 частини сирого казеїну додають 1 частину соляної кислоти (х. ч., d=1,19). При використанні підсушеного казеїну додають на кожну частину ще по ½ чатини дистильованої води. Автоклавують протягом 2год при температурі 127⁰С. потім гідролізат розводять вдвіі і фільтрують через полотно.

Фільтрат розводять дистильованою водою з таким розрахунком, що на кожен кілограм сухого казеїну отримувалось 10л гідролізату (фільтрату). Освітлюють гідролізат шляхом автоклавування його з вугіллям (20-30г/л) при 110⁰С протягом 30хв ф фільтрують через полотно або стерилізуючі пластинки. Гідролізат являє собою прозору рідину злегка жовтуватого відтінку. Ступінь розщеплення в ньому білка не менше 95%.

Дріжджовий екстракт. 1кг хлібних дріжджів розмішують в 5л дистильованої води, доводять рН до 7,6 10% розчином NаОН, автоклавують 30хв при 110⁰С, фільтрують в гарячому стані через кізельгур і додають до 0,2 хлороформу. Використовують протягом декількох днів. Дріжджовий екстракт застосовують замість діалізу.

Умови культивування мікробів для приготування вакцин.

Підготовка посівного матеріалу. Суху культуру відновлюють на середовищі КВА (можна з 5% крові) або Бордо – Жангу, вирощують 2-3 доби. Потім пересівають на пробірки і культуру 44-48 годинного віку після контролю на чистоту і морфологію (мазки за Грамом) використовують для підготовки посівного матеріалу і збереження штаму. Зберігають культуру при 4-10⁰С з пересівами черезкожні 7-10 днів.

Для виробничих посівів використовують не більше 4-5 генерацій (тобто протягом одного місяця).

Культуру для посівного матеріалу і в масовому посіві вирощують протягом 44-48год і обов'язково на кожному етапі перевіряють морфологію і чистоту культури (мазки за Грамом). Змив культури роблять підогрітим до 37⁰С з ізотонічним розчином хлориду натрію. Для отримання посівної суспензії (70-80 МЕМ/мл) в кожен матрас через двохтрубний сифон наливають 60-70мл ізотонічного розчину натрію хлориду і змивають культуру покачуванням. Суспензію збирають окремо з кожного матраса в колби об'ємом 0,5 або 1л з сифоном.

Масовий посів. Із посудини за допомогою сифону суспензію розливають по 3-4мл в матраси, приготовані для масового осіву. Після рівномірного розподілення суспензії по поверхні середовища (покачуванням) матраси укладають по 3-4 в стопки засіяною поверхнею доверху, а на слідуючий день перевертають посівною поверхнею донизу.

Змив культури та обробка мікробної суспензії. Перед змивом культури матраси переглядають і відбирають мікроскопічно вільні від стороннього росту. З них роблять мазки і перевіряють морфологію та відсутність сторонньої мікрофлори. В матраси, які містять лише типові коклюшні мікроби, наливають з бутля з сифоном ізотонічний розчин натрію хлоридиду (охолоджений до 10⁰С) приблизнопо 50-60мл і шляхом покачування змивають мікробну масу.

Суспензію з кожного матрасу за допомогою сифону (під вакуумом) збирають в градуйовані бутлі (5-10л),в яких є фільтри. З кожного бутля беруть пробу для визначення густоти суспензії за стандартом мутності ГІСК ім. Л.А.Тарасевича. Після цього суспензію розводять ізотонічним розчином хлориду натрію до концентрації 80-100 МЕМ/мл.

Для приготування формалінізованої суспензії в бутлі додають за допомогою сифону комерційний формалін до концентрації 0,1%.

Для приготування мертіолатної суспензії в бутлі з суспензією (не більше 4,5л), яка містить 80-100 МЕМ/мл, додають мертіолат (тіомерсал) до концентрації його в суспензії 1:500 або при вмісті 30-40 МЕМ/мл до концентрації 1:10000.

Формалінізована суспензія до зведення в серію АКДП вакцини повинна зберігатися при температурі 3-10⁰С не менше 1/2міс, а мертіолатна – не менше 3міс і не більше 1 1/2р. (обидві суспензії).

На бутлях з мікробною суспензією повинні бути вказані: дата виготовлення, номер штама, серія і номер бутля, кількість суспензії в літрах, густина, рН і спосіб знешкодження.

В деяких країнах для вирощування коклюшних мікробів на виробництві використовують рідкі живильні середовища, вміст яких повністю відповідає пропису Коена та Уіллера або в них вводять також додаткові інгридієнти.

Для застосування рідких середовищ в невеликих об'ємах використовують колби або бутлі ємністю 10-20л.

Для вирощування культури в великих об'ємах використовують спеціальні ферментери різних систем з електронним автоматичним керуванням і реєстрацією основних параметрів, які контролюють при вирощуванні культур (рН, рО₂, температура, густина суспензії).

Рідку культуру при виготовленні вакцини обов'язково звільняють від живильного середовища шляхом центрифугування або сепарування. Осадження мікробної маси соляною кислотою хоча і не сильно знижує протективну активність, але дозволяє відділити з мікробною масою токсичні субстанції.

5.Технологія виготовлення АКДП вакцини.Всі етапи виготовлення кожного компоненту (дифтерійний, коклюшний, правцевий) повинні проходити в окремих приміщеннях. Зведення АКДП вакцини не повинне проходити в приміщенні, яке використовується для виготовлення правцевого анатоксину.

При передачі цих компонентів з одної лабораторії в іншу ОБК проводить контроль і дає відповідний дозвіл на їх зведення.

Для сорбції анатоксинів використовують реактор (бак) або бутлі (градуйовані, ємністю 18-20л) зі спеціальними монтажами сифонів в резиновій пробці.

Адсорбент, а потім анатоксини переливають мірно в реактор (бак). Суміш старанно перемішують протягом 15-20хв (мішалкою або качанням баку) і залишають в холодильнику (3-10⁰С) до наступного дня (на 18-20год). Потім беруть пробу і перевіряють ступінь сорбції анатоксинів. Надосадову рідину не видаляють. При повній сорбції до реактора приєднують стерильно бутлі з коклюшною суспензією і засасують суспензію під вакуум (300мм рт.ст.), а потім необхідну кількість ізотонічного розчину хлориду натрію. Після з'єднання всіх компонентів вміст баку перемішують протягом 30хв.

Зі всіх бутлів беруть проби для контроля (50-100мл).

На нешкідливість перевіряють пробу з кожного бутля даної серії. Вакцину вводять підшкірно одній морській свинці масою 300-400г в кількості 3мл (по 1,5мл в лапку і в бок).

Також проводять контроль токсичності вакцини АКДП на білих мишах, контроль імуногенності АКДП вакцини та визначення захисних властивостей вакцини за відсотком виживання мишей.

Крім АКДП вакцини застосовують також АКДП паракоклюшну (АКДП – пара) вакцину для одночасної імунізації проти коклюша, дифтерії, правця і паракоклюша з додаванням паракоклюшних мікробів.

Поиск по сайту: