Помощничек
Главная | Обратная связь


Археология
Архитектура
Астрономия
Аудит
Биология
Ботаника
Бухгалтерский учёт
Войное дело
Генетика
География
Геология
Дизайн
Искусство
История
Кино
Кулинария
Культура
Литература
Математика
Медицина
Металлургия
Мифология
Музыка
Психология
Религия
Спорт
Строительство
Техника
Транспорт
Туризм
Усадьба
Физика
Фотография
Химия
Экология
Электричество
Электроника
Энергетика

Умови масового культивування мікробів для приготування вакцин

Адсорбована коклюшно – дифтерійно – правцева вакцина

ПЛАН

1. Загальна характеристика АКДП вакцини.

2. Технологія виготовлення коклюшної суспензії для посіву.

3. Методика приготування середовища казеїново- вугільного агару (КВА).

4. Умови масового культивування мікробів для приготування вакцин.

5. Технологія виготовлення АКДП вакцини.

 

1.Адсорбовану коклюшно – дифтерійно – правцева вакцина (АКДП вакцину) в бувшому Радянському Союзі почали застосовувати з 1960р., а в 1964-1965рр. нею повністю замінили коклюшно – дифтерійну (КД) і коклюшно – дифтерійно – правцеву вакцини (КДП), які випускались раніше. АКДП вакцина за ефективністю рівноцінна цим препаратам, але значно менше реактогенна (у ній вдвічі зменшено кількість мікробів і антигенних одиниць анатоксинів).

АКДП вакцини, які випускаються в різних країнах, відрізняються за методами виготовлення, кількісним вмістом у них окремих антигенів та їх якісною характеристикою, що визначає відмінності в реактогенності й ефективності вакцинації.

АКДП вакцина випускається у вигляді, напівпрозорої білуватого кольору рідини.

У 1мл рідкої АКДП вакцини міститься 20 одиниць мутності (МЕМ) (1 МЕМ приблизно дорівнює 1млрд коклюшних мікробів) вбитих коклюшних мікробів (за стандартом ГІСК ім. Л.А.Тарасевича), 30 ЛФ дифтерійного і 10 ЕС правцевого, очищених і концентрованих анатоксинів, не більше 2мг Al2O3 (у вигляді Al(OН)3 ) і 100+20мкг мертіолату (тіомерсалу).

Для виготовлення АКДП вакцини необхідно мати наступні види спечифічної сировини (напівфабрикати): суспензію коклюшних мікробів, очищені концентровані дифтерійний і правцевий анатоксини, гель гідроксиду алюмінію.

2.Технологія виготовлення коклюшної суспензії для посіву.Характеристика і зберігання штамів. Для виготовлення суспензії із коклюшних мікробів (вакцини) використовують штами В.pertussis. За морфологією мікроби – нерухомі, грам-негативні, овоїдної форми палички, які розміщуються в мазках окремо або парами. На щільних середовищах колонії випуклі, круглі, з рівними краями, блискучі, напівпрозорі, діаметром близько 1мм.

Виробничі штами зберігають в ліофілізованому стані при температурі 3-100С. Тривалість зберігання не більше 5 років з обов'язковою щорічною перевіркою перед використанням їх властивостей за всіма показниками.

 

Виготовлення сухих культур. Культуру вирощують на казеїново – вугільному агарі з 5% крові людини або середовищі Борде-Жангу.

Для цього вміст ампули з сухою культурою розчиняють в 0,5мл стерильної дистильованої води або казеїнового гідролізату, засівають на 2 пробірки. Витримують їх в рефрижераторі 18-20год при 40С і в нахиленому положенні 2 дні при 35-360С. Потім культуру пересівають на необхідну кількість пробірок і вирощують 20год. Культуру знімають скляною петлею і готують суспензію густиною 30-50 МЕМ/мл на стерильному розчині, який складається з дистильованої води з 10% сахарози і 1% желатину (рН 7,0 – 7,1). Деякі автори пропонують додавати до цього середовища 0,5% тіосечовини або 5% глутамату натрію. В якості середовища для висушування можна використовувати також стерильне молоко.

Суспензію перевіряють на чистоту (перегляд мазків і посівів) і не пізніше, ніж через 1год після змиву розливають в ампули приблизно по 0,2 – 0,5мл і висушують із замороженого стану при звичайному режимі.

Кожну серію ліофілізованої культури перевіряють на виживання, чистоту, морфологію, культуральні, серологічні, токсичні, захисні властивості. На кожній ампулі обов'язково вказують номер культури, порядковий номер і дату ліофілізації. Після відновлення культуру підтримують пересівами (кожні 7 – 10 днів) на тих же середовищах. Зберігають культуру при температурі 4-100С.

3. Методика приготування середовища казеїново- вугільного агару (КВА).До складу середовища КВА входять: гідролізат казеїну, діалізат або екстрат дріжджів, мінеральні солі, розчинний крохмаль, хлорид цистеїну, активоване вугілля і агар-агар.

Гідролізат казеїну. Гідроліз проводять соляною кислотою під тиском. На 2 частини сирого казеїну додають 1 частину соляної кислоти (х. ч., d=1,19). При використанні підсушеного казеїну додають на кожну частину ще по ½ частини дистильованої води. Автоклавують протягом 2год при температурі 1270С. потім гідролізат розводять вдвічі і фільтрують через полотно.

Фільтрат розводять дистильованою водою з розрахунку, щоб на кожен кілограм сухого казеїну отримувати 10л гідролізату (фільтрату). Освітлюють гідролізат шляхом автоклавування його з вугіллям (20-30г/л) при 1100С протягом 30хв, фільтрують через полотно або стерилізуючі пластинки. Гідролізат - прозора рідина, злегка жовтуватого відтінку. Розщеплення у ньому білка не менше 95%.

Дріжджовий екстракт. 1кг хлібних дріжджів розмішують в 5л дистильованої води, доводять рН до 7,6 10% розчином NаОН, автоклавують 30хв при 1100С, фільтрують в гарячому стані через кізельгур і додають хлороформ. Використовують протягом декількох днів. Дріжджовий екстракт застосовують замість діалізату.

Умови масового культивування мікробів для приготування вакцин.

Підготовка посівного матеріалу. Суху культуру відновлюють на середовищі КВА (можна з 5% крові) або Бордо – Жангу, вирощують 2-3 доби. Потім пересівають на пробірки і культуру 44-48 годинного віку після контролю на чистоту і морфологію (мазки за Грамом) використовують для підготовки посівного матеріалу і збереження штаму. Для виробничих посівів використовують не більше 4-5 генерацій (тобто вирощені протягом одного місяця).

Культуру вирощують протягом 44-48год на матрацах і обов'язково на кожному етапі перевіряють морфологію і чистоту культури (мазки за Грамом). Змив культури роблять підогрітим до 370С ізотонічним розчином хлориду натрію. Для отримання посівної суспензії (70-80 МЕМ/мл) у кожен матрац через двохтрубний сифон наливають 60-70мл ізотонічного розчину натрію хлориду і змивають культуру покачуванням. Суспензію збирають окремо з кожного матраца в колби об'ємом 0,5 або 1л з сифоном.

Масовий посів. Із посудини за допомогою сифону суспензію розливають по 3-4мл в матраци, підготовлені для масового посіву. Після рівномірного розподілення суспензії по поверхні середовища (покачуванням) матраси складають по 3-4 в стопки засіяною поверхнею доверху, а на наступний день перевертають посівною поверхнею донизу.

Змив культури та обробка мікробної суспензії. Перед змивом культури матраси переглядають і відбирають мікроскопічно вільні від стороннього росту. З них роблять мазки і перевіряють морфологію та відсутність сторонньої мікрофлори. В матраси, які містять лише типові коклюшні мікроби, наливають з бутля з сифоном ізотонічний розчин натрію хлоридиду (охолоджений до 100С) приблизно по 50-60мл і покачуванням змивають мікробну масу.

Суспензію з кожного матрасу за допомогою сифону (під вакуумом) збирають в градуйовані бутлі (5-10л),з фільтрами. З кожного бутля беруть пробу для визначення густоти суспензії за стандартом мутності. Після цього суспензію розводять ізотонічним розчином хлориду натрію до концентрації 80-100 МЕМ/мл.

Для приготування стерильної формалінізованої суспензії в бутлі додають за допомогою сифону формалін до концентрації 0,1%.

Для приготування мертіолатної суспензії в бутлі з суспензією (не більше 4,5л), яка містить 80-100 МЕМ/мл, додають мертіолат (тіомерсал) до концентрації його в суспензії 1:500 (або при вмісті 30-40 МЕМ/мл до концентрації 1:10000).

Формалінізована суспензія до зведення в серію АКДП вакцини повинна зберігатися при температурі 3-100С не менше 1/2міс, а мертіолатна – не менше 3міс і обидві суспензії не більше 1/2р.

На бутлях з мікробною суспензією повинні бути вказані: дата виготовлення, номер штама, серія і номер бутля, кількість суспензії в літрах, густина, рН і спосіб знезараження.

У деяких країнах для вирощування коклюшних мікробів на виробництві використовують рідкі живильні середовища, вміст яких повністю відповідає пропису Коена та Уіллера або в них вводять також додаткові інградієнти.

Для застосування рідких середовищ у невеликих об'ємах використовують колби або бутлі ємністю 10-20л.

Для вирощування культури у великих об'ємах використовують спеціальні ферментери різних систем з електронним автоматичним керуванням і реєстрацією основних параметрів, які контролюють при вирощуванні культур (рН, рО2, температура, густина суспензії).

Рідку культуру при виготовленні вакцини обов'язково звільняють від живильного середовища шляхом центрифугування або сепарування. Осадження мікробної маси соляною кислотою не дуже знижує протективну активність, але дозволяє відділити з мікробною масою токсичні субстанції.

5.Технологія виготовлення АКДП вакцини.Всі етапи виготовлення кожного компоненту (дифтерійний, коклюшний, правцевий) повинні проходити в окремих приміщеннях. Зведення АКДП вакцини не повинне проходити в приміщенні, яке використовується для виготовлення правцевого анатоксину.

При передачі цих компонентів з одної лабораторії в іншу ОБК проводить контроль і дає відповідний дозвіл на їх зведення.

Для сорбції анатоксинів використовують реактор (бак) або бутлі (градуйовані, ємністю 18-20л) зі спеціальними монтажами сифонів у різиновій пробці.

Адсорбент, а потім анатоксини переливають мірно в реактор (бак). Суміш старанно перемішують протягом 15-20хв (мішалкою або качанням баку) і залишають в холодильнику (3-100С) на 18-20год. Потім беруть пробу і перевіряють ступінь сорбції анатоксинів. Надосадову рідину не видаляють. При повній сорбції до реактора приєднують стерильно бутлі з коклюшною суспензією і закачують суспензію під вакуумом (300мм рт.ст.), а потім необхідну кількість ізотонічного розчину хлориду натрію. Після з'єднання всіх компонентів вміст баку перемішують протягом 30хв.

Зі всіх бутлів беруть проби для контролю (50-100мл).

На нешкідливість перевіряють пробу з кожного бутля даної серії. Вакцину вводять підшкірно одній морській свинці масою 300-400г в кількості 3мл (по 1,5мл в лапку і в бік).

Також проводять контроль токсичності вакцини АКДП на білих мишах, контроль імуногенності АКДП вакцини та визначення захисних властивостей вакцини за відсотком виживання мишей.

Крім АКДП вакцини застосовують також АКДП паракоклюшну (АКДП – пара) вакцину для одночасної імунізації проти коклюша, дифтерії, правця і паракоклюша з додаванням паракоклюшних мікробів.




©2015 studopedya.ru Все права принадлежат авторам размещенных материалов.