3. Раствор «хромовая смесь», красители по Граму; банка со спиртом 960;
4. Хозяйственное мыло, пинцет, карандаш по стеклу,
5. Микроскоп;
6. Пробы природной воды, Водопроводная вода - контроль
Методика микрокопирования препарата
Для приготовления препаратов необходимы предметные и покровные стекла. Толщина предметных стекол желательно не более 1,2 - 1,5 мм.
Стекла перед употреблением предварительно обезжиривают погружением на 24 часа концентрированную серную кислоту и кипячением в течение 20 мин в «хромовой смеси». Затем стекла тщательно промывают в проточной водопроводной воде, помещают в банку со спиртом 960, которую плотно закрывают притертой пробкой.
Спирт должен быть без следов жира. Перед употреблением стекла вынимают из банки пинцетом и высушивают на воздухе.
Провести описание микробного пейзажа мазков методом микроскопирования пробы.
Методика приготовления мазка
Методика приготовления мазка из культуры, выращенной на плотной питательной среде:
1. Приготовить рабочий стол;
2. Зажечь спиртовку и прокалить бактериальную петлю;
3. Петлей нанести на предметное стекло каплю воды;
4. Петлю обжечь;
5. Петлей взять небольшое количество исследуемого материала, соблюдая правила стерильности;
6. Перенести материал в каплю воды на предметном стекле и тщательно растереть, чтобы получилось мутное пятно;
7. Петлю вновь обжечь;
8. Зафиксировать мазок, проведя над пламенем 3-4 раза;
9. Дать мазку подсохнуть;
10. Окрасить по Граму.
Методика приготовления мазка из культуры, выращенной на жидкой питательной среде:
При приготовлении мазка из жидкой питательной среды: каплюпитательной среды нанести на предметное стекло и фиксируют над пламенем горелки т.е. быстро проводят 3 раза над пламенем, так чтобы мазок прогревался до 70-800С в течение 3-4 с, затем высушивают.
PS: Кроме фиксации над огнем, для мазков применима фиксация в метиловом спирте (5 мин) или в парах формалина (в сосуде Коплина) в течение 15 мин.
Окраска по Граму
Техника окраски по Граму:
1.Приготовить фиксированный мазок;
2. На мазок кладём фильтровальную бумагу;
3. На бумагу капнуть 1-2 капли генцианвиолета и окрасить в течение 1-2 мин;
4. Сливают краску, аккуратно удаляют фильтровальную бумагу и быстро споласкивают в водопроводной воде (15—30 сек), т.е. краску вместе с бумагой смыть (промывать водой не надо);
5. Окрасить препарат раствором Люголя на фильтровальной бумаге в течение 1-2 мин иди другим йодистым раствором;
Раствор сливают, мазок промывают водой (водопроводной или дистилированной).
6. Дифференцируют 96° спиртом, наливая и сливая его, пока отходит синяя краска и не обесцветится мазок (приблизительно 20-40-60 секунд). Во время дифференцировки препарат все время покачивают.
Если вместо спирта использовать ацетон, то промывание продолжается 30 с. Можно дифференцировать смесью спирта и ацетона (1:1) 30 с.
7. Промывают стекла в проточной или дистиллированной воде 1 — 2 мин.
8. Дополнительно окрашивают (для выявления грамотрицательной группы бактерий) либо 0,5% водным раствором нейтрального красного (нейтральрот), либо разведенным (в 10 раз) карболфуксином Циля — 1-2-3 минуты. Возможна докраска сафранином (0,2-0,5 % водный раствор или 0,25 % раствор в 10 % спирте) основным коричневым (бисмаркбраун) либо пиронином J или В (2-5 мин).
9. Промывают в проточной воде 5 с и высушивают фильтровальной бумагой.
PS: 1. Очень удобно работать с полосками фильтровальной бумаги, предварительно пропитанной 1% спиртовым раствором одного из вышеуказанных красителей и затем высушенной. Такую окрашенную и высушенную бумагу накладывают на мазок и смачивают дистиллированной водой. Продолжительность окрашивания остается прежней (2—3 мин.).
2.Йодистые растворы:
1. по Граму:2 г йодида калия растворяют в 2-3 мл дистиллированной воды, добавляют 1 г кристаллического йода, доливают до 300 мл дистиллированной воды;
2. по Вейгерту: 2 г йодида калия растворяют в 2-3 мл дистиллированной воды, добавляют 1 г кристаллического йода до 100 мл дистиллированной воды.
3. Следует заметить, что в классической прописи при окраске по Граму обычно не промывают мазки в воде ни после окраски генциановым фиолетовым (кристаллическим фиолетовым), ни после обработки раствором Люголя, ограничиваются лишь сливанием растворов. Предлагаемое промывание в воде имеет целью только чистоту в работе, тем более, что оно ни в какой мере не отражается на результатах окрашивания.
В результатеграмположительные бактерии окрашиваются в иссиня-черный (темно-синий) цвет, грамотрицательные - в красный или коричневый в зависимости от красителя; ядра клеток — ярко-красные, цитоплазма — розовая.
Список литературы
1. Аристовская Т.В. и др. Большой практикум по микробиологии М., «Высшая школа», 1962. С.