Фосфитный триэфирный метод

В 1970-х гг. в практику был введен фосфиттриэфирный метод образования межнуклеозидных связей, в котором были использованы существенно более реакционноспособные нуклеозидные производные на основе P(III), первоначально хлорофосфиты.^[26] Позже, группа под руководством М. Карузерса (M. Caruthers) использовала менее агрессивные и более селективные 1H-тетразолидофосфиты и реализовала метод в твердофазном варианте.^[27] Вскоре после этого сотрудники из той же группы улучшили метод путём использования в качестве строительных блоков более стабильных нуклеозидных амидофосфитов. Замена менее практичной метильной защитной группы фосфата^[28][29][30] на более удобную 2-цианэтильную группу^[31] дала тот вариант нуклеозидных амидофосфитов, который является стандартом реагентов для синтеза олигонуклеотидов и по настоящее время. Многочисленные дальнейшие усовершенствования методов синтеза мономерных блоков, олигонуклеотидных синтезаторов и протоколов сборки и деблокирования превратили амидофосфитный подход в очень надёжный и производительный метод получения синтетических олигонуклеотидов.^[1]

Тиофосфатные олигонуклеотиды и их синтез

Тиофосфатные олигонуклеотиды — это модифицированные олигонуклеотиды, в которых один из атомов кислорода в фосфатном остатке замещен на атом серы. Широко используются только те тиофосфаты, в которых сера не является связующим звеном между нуклеозидным остатком и атомом фосфора. В этом случае замена кислорода на серу приводит к образованию нового центрахиральности на атоме P(V), поэтому в простейшем случае динуклеотида образуются S_P- и R_P-диастереомеры. В n-мерном олигонуклеотиде, в котором все (n-1) межнуклеотидных связей являются тиофосфатными, число диастереомеров составляет 2^(n-1). Будучи неприродными аналогами нуклеиновых кислот, олигонуклеотидные тиофосфаты значительно более устойчивы к гидролизу нуклеазами, классом ферментов, расщепляющих нуклеиновые кислоты путем гидролиза P-O-связи фосфодиэфирного мостика. Это свойство определяет использование тиофосфатов в качестве антисмысловых олигонуклеотидов в приложениях in vivo и in vitro, где неизбежно воздействие нуклеаз. Подобным образом, чтобы увеличить стабильность малых интерферирующих РНК, часто вводят, по крайней мере, одну тиофосфатную связь в 3'-положение смысловой и антисмысловой цепи. В оптически чистых олигонуклеотидных тиофосфатах диастереомеры, в которых все фосфорные центры имеют S_P-конфигурацию, более устойчивы к ферментативному гидролизу, чем их R_P-аналоги. Однако, синтез оптически чистых тиофосфатов сложен. В лабораторной практике обычно пользуются смесями диастереомеров.

Синтез олигонуклеотидных тиофосфатов аналогичен синтезу природных олигонуклеотидов. Различие заключается в том, что стадия окисления заменяется реакцией сульфурирования. Кэпирование в данном случае проводится после сульфурирования. Для введения серы применяются три коммерчески доступных реагента:

· 3-(Диметиламинометилиденамино)-3H-1,2,4-дитиазол-3-тион (DDTT) обеспечивает высокую скорость сульфурирования и обладает стабильностью в растворе.^[

· Реагент Бокажа (Beaucage Reagent) имеет более высокую растворимость в ацетонитриле и обеспечивает протекание реакции за более короткое время. Однако, он имеет ограниченную стабильность в растворе и менее эффективен при сульфурировании связей РНК.

· N,N,N',N'-Тетраэтилтиурамдисульфид (TETD) растворим в ацетонитриле, однако, реакция сульфурирования межнуклеозидной связи ДНК занимает 15 мин, что в 10 раз медленнее, чем в случае двух предыдущих соединений.

Автоматизация

Ранее олигонуклеотидный синтез проводился вручную в растворе или на твёрдой фазе. Твердофазный синтез был реализован с использованием миниатюрных стеклянных колонок, снабжённых пористыми фильтрами. В настоящее время твердофазный синтез проводится автоматически на олигонуклеотидных синтезаторах, управляемых компьютерами. Он может быть реализован в колоночном, планшетном или чиповом формате. Колоночный формат подходит для исследовательских или крупномасштабных целей, для которых высокая производительность не является критичной. Планшетный формат разработан специально для высокопроизводительного синтеза в малом масштабе для удовлетворения растущей потребности производства и науки в синтетических олигонуклеотидах. Различные виды синтезаторов коммерчески доступны.

Пост-синтетическая обработка

После завершения сборки цепи олигонуклеотид полностью защищён:

· 5'-концевая гидроксильная группа защищена DMT-группой;

· межнуклеозидные фосфатные группы защищены 2-цианэтильными группами;

· экзоциклические аминогруппы во всех нуклеиновых основаниях, кроме T и U, защищены ацильными защитными группами.

Для получения целевого олигонуклеотида необходимо удалить все защитные группы. Защита оснований и цианэтильные защитные группы обычно удаляются одновременно при обработке неорганическими основаниями или аминами. Применение данного метода, однако, ограничено тем, что при такой обработке в качестве побочного продукта образуетсяакрилонитрил. В условиях снятия защитных групп акрилонитрил может алкилировать азотистые основания, в основном, N3-положение тимина и урацила с образованием 2-цианэтильных производных по реакции Михаэля. Образования этих побочных продуктов можно избежать обработкой олигонуклеотидов, связанных с твердофазным носителем, растворами оснований в органическом растворителе, например, 50%-ым триэтиламином в ацетонитриле или 10%-ым диэтиламином в ацетонитриле. Такая обработка рекомендуется для синтеза в большом и среднем масштабе. Когда синтез проводится в малом масштабе, концентрация образующегося акрилонитрила в деблокируюшем растворе низка, и предварительное удаление цианоэтильной группы не является обязательным.

Как правило, олигонуклеотиды, связанные с носителем, обрабатывают по одной из двух схем:

· Наиболее часто 5'-DMT-группа удаляется в конце синтеза, а олигонуклеотиды снимаются с носителя и деблокируются под действием водного аммиака, водного метиламина, их смесей, газообразных аммиака или метиламина, реже растворами других первичных аминов и щелочей при комнатной либо повышенной температуре. Такая обработка удаляет все защитные группы с 2'-дезоксиолигонуклеотидов, давая конечный продукт в растворе. В случае 2'-O-силилзащищённых олигорибонуклеотидов добавляется стадия удаления силильных защитных групп под действием фторид-иона. Незащищённый продукт используется без дальнейшей очистки или очищается одним из нижеследующих методов. При грубой очистке, олигонуклеотид обессоливается осаждением в этанол, гель-фильтрацией или обращённо-фазовой ВЭЖХ. Тонкая очистка проводится с целью удаления укороченных (кэпированных) и модифицированных последовательностей; для этого олигонуклеотиды очищают электрофорезом в полиакриламидном геле или анионно-обменнойВЭЖХ с последующим обессоливанием.

· Второй подход используется, если целевой олигонуклеотид планируется очищать посредством обращённо-фазовой ВЭЖХ. В этом случае 5'-концевая DMT-группа сохраняется и в дальнейшем служит в качестве гидрофобной метки. Олигонуклеотид деблокируется в основных условиях, как в первом подходе, и после упаривания очищается обращённо-фазовой ВЭЖХ. При этом его подвижность значительно отличается от подвижности кэпированных последовательностей благодаря наличию дополнительной гидрофобной группы, что упрощает его выделение в чистом виде. DMT-группа затем удаляется в кислой среде, например, 80%-ой водной уксусной кислоте в течение 15-30 мин при комнатной температуре. Затем раствор упаривают и обессоливают, как описано выше.

· При необходимости, в олигонуклеотид вводят дополнительные 5'-модификации, например нерадиоактивные метки, используя одну из пост-синтетических методик.

Поиск по сайту: