Помощничек
Главная | Обратная связь


Археология
Архитектура
Астрономия
Аудит
Биология
Ботаника
Бухгалтерский учёт
Войное дело
Генетика
География
Геология
Дизайн
Искусство
История
Кино
Кулинария
Культура
Литература
Математика
Медицина
Металлургия
Мифология
Музыка
Психология
Религия
Спорт
Строительство
Техника
Транспорт
Туризм
Усадьба
Физика
Фотография
Химия
Экология
Электричество
Электроника
Энергетика

Б. Антивирусные и антибактериальные препараты



Азидотимидин (AZT, или зидовидин) представляет собой мощный противовирусный препарат, применяющийся в лечении инфекций, которые сопровождают приобретённые формы иммунодефицита. Будучи структурным аналогом тимид-на, препарат имеет в З'-положении дезоксирибозы азидогруппу .

AZT может фосфорилироваться и с помощью ДНК-полимераз включаться в растущую молекулу ДНК. Однако присутствие в 3'-положении дезоксирибозы азидогруппы делает синтезирующиеся молекулы ДНК не способными к последующему удлинению. В результате образование новых молекул ДНК прекращается.

Важно, что фосфорилированные производные AZT утилизируются более эффективно вирусной ДНК-полимеразой или так называемой обратной транскриптазой, чем ДНК-полимеразами эукариотов, поэтому препарат наиболее эффективно влияет на размножение вирусов и, в частности, ретровируса, вызывающего ВИЧ-инфекцию.

5-йоддезоксиуридиниспользуют в терапии кератитов и поражений роговицы глаза вирусом герпеса.

Азатиопринв организме превращается в 6-меркаптопурин, который оказывает мощное иммуносупрессорное действие. Препарат широко используют в трансплантологии для предотвращения развития иммунологических реакций, вызывающих отторжение трансплантата.

Азотистые основания, входящие в структуру нуклеиновых кислот – пуриновые и пиримидиновые. Нуклеотиды, содержащие рибозу и дезоксирибозу. Структура. Номенклатура.

 

Первичная структура нуклеиновых кислот. ДНК и РНК–черты сходства и различия состава, локализации в клетке, функции. Вторичная структура ДНК (модель Уотсона и Крика). Связи, стабилизирующие вторичную структуру ДНК. Комплементарность. Правило Чаргаффа. Полярность. Антипараллельность.

Первичная структура ДНК -порядок чередования дезоксирибонуклеозидмонофосфатов (дНМФ) в полинукпеотидной цепи.

Каждая фосфатная группа в полинукпеотидной цепи, за исключением фосфорного остатка на 5'-конце молекулы, участвует в образовании двух эфирных связей с участием 3'- и 5'-углеродных атомов двух соседних дезоксирибоз, поэтому связь между мономерами обозначают 3', 5'-фосфодиэфирной.

Концевые нуклеотиды ДНК различают по структуре: на 5'-конце находится фосфатная группа, а на 3'-конце цепи - свободная ОН-группа. Эти концы называют 5'- и 3'-концами. Линейная последовательность дезоксирибонуклеотидов в полимерной цепи ДНК обычно сокращённо записывают с помощью однобуквенного кода, например -A-G-C-T-T-A-C-A- от 5'- к 3'-концу.

В каждом мономере нуклеиновой кислоты присутствует остаток фосфорной кислоты. При рН 7 фосфатная группа полностью ионизирована, поэтому in vivoнуклеиновые кислоты существуют в виде полианионов (имеют множественный отрицательный заряд). Остатки пентоз тоже проявляют гидрофильные свойства. Азотистые основания почти нерастворимы в воде, но некоторые атомы пуринового и пиримидинового циклов способны образовывать водородные связи.

Первичная структура РНК -порядок чередования рибонуклеозидмонофосфатов (НМФ) в полинуклеотидной

Концы полинуклеотидных цепей РНК неодинаковы. На одном конце находится фосфорилированная ОН-группа 5'-углеродного атома, на другом конце - ОН-группа 3'-углеродного атома рибозы, поэтому концы называют 5'- и 3'-концами цепи РНК. Гидроксильная группа у 2'-углеродного атома рибозы делает молекулу РНК нестабильной. Так, в слабощелочной среде молекулы РНК гидролизуются даже при нормальной температуре, тогда как структура цепи ДНК не изменяется.

Признаки ДНК РНК
Местонахождение в клетке Ядро, митохондрии, хлоропласты Ядро, рибосомы, цитоплазмы, митохондрии, хролопласты
Местонахождение в ядре Хромосомы Ядрышко
Строение макромолекулы Двойной неразветвленный линейный полимер, свернутый правозакрученной спиралью Одинарная полинуклеотидная цепочка
Мономеры Дезоксирибонуклеотиды Рибонуклеотиды
Состав нуклеотид а Азонистое основание (пуриновое-аденин, гуанин, пиримидиновое – тимин, цитозин); дезоксирибоза (углевод); остаток фосфорной кислоты Азонистое основание (пуриновое-аденин, гуанин, пиримидиновое-урацил, цитозин);рибоза (углевод); остаток фосфорной кислоты
Типы нуклеидов Адениловый (А), гуаниловый(Г), тимидиловый (Т), цитидиловый (Ц) Адениловый (А), гуаниловый (Г), уридиловый (Т),цитидиловый (Ц)
Свойства Способная к самоудвоению по принципу комплементарности А=Т, Т=А, Г=Ц, Ц=Г Стабильна. Не способна к самоудвоению. Лабильна.
Функции Химическая основа хромосомного генетического материала (гена); синтез ДНК, синтез РНК, информация о структуре белков. Информационная (иРНК) – передает код наследственной информации о первичной структуре белковой молекулы, рибосомальная (рРНК) – входит в состав рибосом; транспортная (тРНК) – переносит аминокислоты к рибосомам; митохондриальная и платидная РНК – входят в состав рибосом этих органелл

Вторичная структура ДНК.В 1953 г. Дж. Уотсоном и Ф. Криком была предложена модель пространственной структуры ДНК. Согласно этой модели, молекула ДНК имеет форму спирали, образованную двумя полинуклеотидными цепями, закрученными относительно друг друга и вокруг общей оси. Двойная спираль правозакрученная,полинуклеотидньхе цепи в ней антипараллельны, т.е. если одна из них ориентирована в направлении 3'→5', то вторая - в направлении 5'→3'. Поэтому на каждом из концов

 

Все основания цепей ДНК расположены внутри двойной спирали, а пентозофосфатный остов - снаружи. Полинуклеотидные цепи удерживаются относительно друг друга за счёт водородных связей между комплементарными пуриновыми и пиримидиновыми азотистыми основаниями А и Т (две связи) и между G и С (три связи). При таком сочетании каждая пара содержит по три кольца, поэтому общий размер этих пар оснований одинаков по всей длине молекулы. Водородные связи при других сочетаниях оснований в паре возможны, но они значительно слабее. Последовательность нуклеотидов одной цепи полностью комплементарна последовательности нуклеотидов второй цепи. Поэтому, согласно правилу Чаргаффа (Эрвин Чаргафф в 1951 г. установил закономерности в соотношении пуриновых и пиримидиновых оснований в молекуле ДНК), число пуриновых оснований (А + G) равно числу пиримидиновых оснований (Т + С).

Комплементарые основания уложены в стопку в сердцевине спирали. Между основаниями двухцепочечной молекулы в стопке возникают гидрофобные взаимодействия,стабилизирующие двойную спираль.

Такая структура исключает контакт азотистых остатков с водой, но стопка оснований не может быть абсолютно вертикальной. Пары оснований слегка смещены относительно друг друга. В образованной структуре различают две бороздки - большую, шириной 2,2 нм, и малую, шириной 1,2 нм. Азотистые основания в области большой и малой бороздок взаимодействуют со специфическими белками, участвующими в организации структуры хроматина.

Гибридизация нуклеиновых кислот. Денатурация и ренативация ДНК. Гибридизация (ДНК-ДНК, ДНК-РНК). Методы лабораторной диагностики, основанные на гибридизации нуклеиновых кислот.(ПЦР)

На явлении денатурации и ренативации основан метод, называемый "молекулярная гибридизация".Процесс гибридизации может осуществляться между двумя любыми цепями нуклеиновых кислот (ДНК-ДНК, ДНК-РНК) при условии, что они содержат комплементарные последовательности нуклеотидов. Такие гибридные структуры можно выделить центрифугированием в градиенте плотности сахарозы или наблюдать в электронном микроскопе .

Если раствор, содержащий образцы ДНК 1 и 2, выделенные из организмов разных видов, денатурировать, а затем провести ренатива-цию, то образуются двухспиральные структуры. Но наряду с исходными ДНК 1 и ДНК 2 образуются гибридные двойные спирали, содержащие цепь ДНК образца 1 и цепь ДНК образца 2, где присутствуют как спирализованные, так и неспирализованные участки. В неспирализованных участках фрагменты цепей ДНК не комплементарны, т.е. в ходе гибридизации получаются несовершенные гибриды. Методом молекулярной гибридизации можно установить:

  • сходство и различие первичной структуры разных образцов нуклеиновых кислот;
  • различие ДНК, выделенных из организмов разных видов;
  • идентичность ДНК всех органов и тканей одного организма.

При проведении гибридизации ДНК-РНК были выделены гибридные молекулы, содержащие одну цепь ДНК и одну цепь РНК. Если для эксперимента были взяты ДНК и РНК (первичный транскрипт), выделенные из одного организма, то образовывались совершенные гибриды, потому что молекула РНК комплементарна цепи ДНК. Гибридизацией ДНК-РНК было впервые установлено, что все виды РНК клетки имеют на молекуле ДНК комплементарные участки.

Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), предложенный в 1983 г. Карри Муллисом (Нобелевская премия, 1993 г.), явился эпохальным открытием XX века в области молекулярной биологии. Он позволяет подвергать специфичной амплификации в условиях in vitro (в пробирке) участки ДНК длиной от нескольких десятков до нескольких сотен пар нуклеотидов, используя в качестве матрицы любые образцы ДНК. Необходимое условие для проведения ПЦР - знание нуклеотидной последовательности амплифицируемой области. Участок исследуемой ДНК гибридизуют с двумя искусственно синтезированными праймерами - олигодезоксирибонуклеотидными последовательностями длиной от 15 до 30 пар нуклеотидов, которые комплементарны 3'-концам амплифицируемого участка на кодирующей и некодирующей нитях ДНК. Расстояние между праймерами определяет длину синтезируемых молекул. В качестве матрицы для синтеза продуктов ПЦР используют любой тип ДНК: геномную ДНК человека, различных видов про- и эукариотов, ДНК, выделенную из культур клеток, "библиотек" генов и других источников. Метод не требует больших количеств исследуемой ДНК, в принципе, достаточно даже одной молекулы, содержащейся в одном волосе на голове, одной капле крови или спермы.

Успех в разработке метода в значительной степени обусловлен использованием в качестве фермента термофильной ДНК-полимеразы, выделенной из бактерий, живущих в горячих источниках, и потому устойчивой к действию высоких температур.

Реакционная смесь для получения интересующей нас ДНК содержит исследуемую ДНК, субстраты реакции - 4 дНТФ, 2 праймера, термостабильную, или Taq-полимеразу и буфер, содержащий ионы Mg2+.

Один цикл полимеризации включает 3 этапа (рис. 4-67):

· плавление:на этой стадии реакционную смесь нагревают до температуры 90-97 °С. Исследуемая двуцепочечная ДНК денатурирует и переходит в однонитевую форму;

· гибридизация или отжиг ДНК с праймерами.В результате снижения температуры до 50-60 °С происходит комплементарное связывание праймеров с цепями матричной ДНК и образование двухцепочечного участка на каждой из нитей ДНК;

· элонгация,удлинение нитей ДНК, комплементарных матричной ДНК, катализирует Taq-полимераза в направлении от 5'- к 3'-концу.

Затем снова наступает этап плавления, когда за счёт повышения температуры синтез ДНК прекращается, и двунитевой участок между матричными и вновь синтезированными молекулами ДНК денатурирует. Во втором и последующих циклах праймеры гибридизируются с исходной матричной ДНК и с вновь синтезированными молекулами ДНК, количество которых нарастает в геометрической прогрессии. В последнем случае синтез ДНК заканчивается не из-за изменения температурного режима, а по достижении ДНК-полиМеразой границы амплифицированного участка, что определяет строго определённый размер продукта с точностью до одного нуклеотида.

Каждый из этапов цикла имеет продолжительность от десятков секунд до 1-3 мин, в результате полный цикл длится от одной до нескольких минут.

Описанную процедуру амплификации ДНК проводят в автоматическом режиме в приборе - циклизаторе, или термоциклере, амплификаторе ДНК. Такой прибор позволяет задавать нужное количество циклов и выбирать оптимальные временные и температурные параметры. За 25-30 циклов число синтезированных копий ДНК достигает нескольких миллионов.

С помощью ПЦР можно получить достаточное количество копий участков ДНК, в которых предполагаются присутствие мутаций, полиморфизм сайтов, можно проводить ДНК-диагностику инфицированности пациентов вирусными, бактериальными и грибковыми возбудителями болезней.

Третичная структура ДНК. Роль гистоновых и негистоновых белков в компактизации ДНК. Организация хроматина. Ковалентная модификация гистонов и ее роль в регуляции структуры и активности хроматина.

Каждая молекула ДНК упакована в отдельную хромосому. В диплоидных клетках человека содержится 46 хромосом.Общая длина ДНК всех хромосом клетки составляет 1,74 м, но она упакована в ядре, диаметр которого в миллионы раз меньше. Чтобы расположить ДНК в ядре клетки, должна быть сформирована очень компактная структура. Компактизация и суперспирализация ДНК осуществляются с помощью разнообразных белков, взаимодействующих с определёнными последовательностями в структуре ДНК. Все связывающиеся с ДНК эукариотов белки можно разделить на 2 группы: гисгоновые и негистоновые белки.Комплекс белков с ядерной ДНК клеток называют хроматином.

Гистоны- белки с молекулярной массой 11-21 кД, содержащие много остатков аргинина и лизина. Благодаря положительному заряду гистоны образуют ионные связи с отрицательно заряженными фосфатными группами, расположенными на внешней стороне двойной спирали ДНК.

Существует 5 типов гистонов. Четыре гистона Н2А, Н2В, НЗ и Н4 образуют октамерный белковый комплекс (Н2А, Н2В, НЗ, Н4)2, который называют "нуклеосомный кор"(от англ.nucleosome core). Молекула ДНК "накручивается" на поверхность гистонового октамера, совершая 1,75 оборота (около 146 пар нуклеоти-дов). Такой комплекс гистоновых белков с ДНК служит основной структурной единицей хроматина, её называют "нуклеосома".ДНК, связывающую нуклеосомные частицы, называют линкерной ДНК. В среднем линкерная ДНК составляет 60 пар нуклеотидных остатков. Молекулы гистона H1 связываются с ДНК в межнуклеосомных участках (линкерных последовательностях) и защищают эти участки от действия нуклеаз .

В ядре каждой клетки присутствует около 60 млн молекул каждого типа гистонов, а общая масса гистонов примерно равна содержанию ДНК. Аминокислотные остатки лизина, аргинина и концевые аминогруппы гистонов могут модифицироваться: ацетилироваться, фосфорилироваться, метилироваться или взаимодействовать с белком убиквитином (негистоновый белок). Модификации бывают обратимыми и необратимыми, они изменяют заряд и конформацию гистонов, а это влияет на взаимодействие гистонов между собой и с ДНК. Активность ферментов, ответственных за модификации, регулируется и зависит от стадии клеточного цикла. Модификации делают возможными конформационные перестройки хроматина.

 




Поиск по сайту:

©2015-2020 studopedya.ru Все права принадлежат авторам размещенных материалов.